توليف لشل الأساسية لانثانيدات يخدر نانوكريستالس Upconversion لتطبيقات الهاتف الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع بلورات نانوية مخدرة باللانثانيد بناء على نهج الترسيب المشترك في درجات الحرارة العالية وإجراء تعديلات سطحية متوافقة حيويا تتيح المزيد من التطبيقات الخلوية. في السنوات القليلة الماضية ، طور مختبرنا تحويلا فريدا جدا من البلورات النانوية المخدر باللانثانيد ، مما يشير إلى خصائص بصرية فريدة للغاية ، والتي يمكنها امتصاص ضوء الأشعة تحت الحمراء ذات الطول الموجي الطويل وتحويل هذا الضوء بشكل أساسي إلى انبعاثات متعددة الألوان في نطاق قصير من الطول الموجي ، بما في ذلك الأشعة فوق البنفسجية المرئية حتى لنوافذ ضوء الأشعة تحت الحمراء. أشارت هذه الهياكل الفريدة من نوعها إلى خصائص واعدة للغاية للتطبيقات الطبية الحيوية.

توفر هذه الطريقة نهجا مجديا لتصنيع الهياكل النانوية ذات التحويل الرأسي للغلاف الأساسي وتقنية تعديل السطح المتوافقة حيويا لتنظيم بروتين قناة غشاء بوابة الضوء عند إضاءة ضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة. لبدء الإجراء ، قم بإعداد محاليل مخزون من مجمعات الأسيتات الأرضية النادرة في الميثانول. تحضير 20 ملليغرام لكل مليلتر من هيدروكسيد الصوديوم وفلوريد الأمونيوم في الميثانول.

قم بتخزين حلول المخزون عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتقطيع الماصة ثلاثة ملليلتر من حمض الأوليك وسبعة ملليلتر من 1-أوكتاديسين في قارورة 50 ملليلتر وثلاثية العنق ومستديرة القاع. أضف إلى ذلك ، 1.089 مل من محلول أسيتات الإيتريوم ، و 0.608 مل من محلول أسيتات الإيتربيوم ، و 83.6 ميكرولتر من محلول أسيتات الثوليوم ، و 128.5 ميكرولتر من محلول أسيتات النيوديميوم.

جهز القارورة بقضيب تحريك ومقياس حرارة. سخني القارورة إلى 100 درجة مئوية في حمام زيت مع التحريك حتى يتبخر الميثانول. بعد ذلك ، قم بتوصيل القارورة بخط Schlenk ، وضخ القارورة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لإزالة الميثانول المتبقي.

بعد ذلك ، ضع القارورة تحت جو من النيتروجين. سخني خليط التفاعل على حرارة 150 درجة مئوية لمدة ساعة مع التحريك عند 700 دورة في الدقيقة. ثم اترك الخليط يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، ضع في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر ملليلترين من محلول مخزون هيدروكسيد الصوديوم و 2.965 مل من محلول مخزون فلوريد الأمونيوم. قم بتغطية الأنبوب بإحكام ، وقم بدوامة خليط هيدروكسيد الصوديوم وفلوريد الأمونيوم لمدة خمس ثوان. على مدار خمس دقائق، استخدم ماصة زجاجية لإضافة خليط هيدروكسيد الصوديوم وفلوريد الأمونيوم ببطء إلى قارورة التفاعل أثناء التحريك.

ثم سخني خليط التفاعل إلى ما لا يزيد عن 50 درجة مئوية. امسك الخليط في درجة الحرارة هذه لمدة 30 دقيقة. ثم سخني الخليط إلى 100 درجة مئوية لتبخر الميثانول.

قم بتوصيل القارورة بخط Schlenk ، وقم بإزالة الميثانول المتبقي تحت الفراغ لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. املأ القارورة بغاز النيتروجين ، وقم بتسخين خليط التفاعل إلى 290 درجة مئوية عند خمس درجات مئوية في الدقيقة. احتفظ بالخليط عند 290 درجة مئوية أو أعلى بقليل لمدة 1.5 ساعة.

ثم اترك الخليط يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة مع التحريك. انقل خليط المنتج إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. شطف البقايا في الأنبوب مع 30 مل من الإيثانول.

الطرد المركزي الخليط على حرارة 4 ، 000 مرة جم لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتفريق المواد الصلبة في 10 ملليلتر من الهكسان عن طريق الصوتنة لمدة دقيقتين. أضف 30 مل من الإيثانول إلى التشتت ، وقم بالطرد المركزي للخليط مرة أخرى في نفس الظروف ، وتخلص من المادة الطافية.

قم بتفريق المواد الصلبة في خمسة ملليلتر من الهكسانات ، وقم بتخزين التشتت عند أربع درجات مئوية. تحقق من الانبعاث المحول لمحلول UCNs ذو الغلاف الأساسي عند تشعيع الليزر 808 نانومتر في الظلام. لبدء تحضير UCNs المعدلة ب DBCO ، اغسل البلورات النانوية ذات القشرة الأساسية المحضرة في 30 مل من الإيثانول عن طريق الطرد المركزي.

تخلص من المادة الطافية ، وأضف 10 مل من محلول مائي من حمض الهيدروكلوريك. قم بتقطيع الخليط لمدة 30 دقيقة لإذابة المواد الصلبة. انقلي المزيج إلى قارورة زجاجية وقلبي بقوة لمدة ساعتين.

ثم اغسل الخليط بأربعة أجزاء سعة 30 ملليلتر من ثنائي إيثيل الأثير. امزج كسور الأثير ، واترك جانبا الطبقة المائية المغسولة. استرجع UCNs الخالية من الترابط من طبقات الأثير بسعة 10 مل من الماء منزوع الأيونات ، واجمع بين الطبقات المائية.

أضف 20 مل من الأسيتون إلى الطبقات المائية المدمجة ، وقم بتدوير الخليط لمدة خمس ثوان. الطرد المركزي الخليط على 35 ، 000 مرة غرام لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وقم بإذابة الراسب في ملليلترين من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول UCNs الخالية من الترابط.

بعد ذلك ، قم بإذابة 200 ملليغرام من حمض البولي أكريليك في 20 مل من الماء منزوع الأيونات عن طريق الصوتنة لمدة 20 دقيقة. أضف إلى ذلك محلول UCNs الخالية من الترابط مع التحريك بقوة. اضبط درجة الحموضة في الخليط على 7.4 بمحلول واحد من هيدروكسيد الصوديوم.

قم بتسخين الخليط لمدة 30 دقيقة ، وحرك الخليط لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم ، قم بالطرد المركزي للخليط على 35 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق. اغسل المواد الصلبة عن طريق الطرد المركزي في 10 مل من الماء منزوع الأيونات أربع مرات.

قم بتفريق المواد الصلبة المغسولة في ثمانية ملليلتر من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول 10 ملليغرام لكل مليلتر من UCNs المعدلة بالبوليمر. جهاز طرد مركزي واحد ملليغرام من [كنس] بالبوليمر المعدلة في 35,000 مرات [غ] ل 10 دقائق. قم بتخزين المحلول المتبقي عند أربع درجات مئوية.

اغسل المواد الصلبة عن طريق الطرد المركزي في أجزاء سعة مليلتر واحد من DMF الجاف ثلاث مرات. ثم قم بإذابة الراسب في 200 ميكرولتر من DMF الجاف. أضف إلى هذا المحلول 12.2 ملليغرام من HOBT ، و 14 ملليغرام من EDC ، وخمسة ملليغرام من DBCO-amine ، و 16 ميكرولتر من DIPEA.

قلب الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. ثم ، قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 10 دقائق عند 35 ، 000 مرة جم. اغسل المواد الصلبة أربع مرات عن طريق الطرد المركزي في أجزاء سعة ملليلتر واحد من DMSO.

قم بتفريق UCNs المعدلة بواسطة DBCO في 0.2 مل من DMSO ، وقم بتخزين التشتت عند أربع درجات مئوية. أولا ، قم بزرع 10 خلايا HEK293 الخامسة في صفيحة من 12 بئرا ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، اجمع ميكروغراما واحدا من البلازميد المختار مع ميكرولترين من عامل التعداء P3000 في 100 ميكرولتر من MEM.

في أنبوب طرد مركزي دقيق آخر ، امزج 1.5 ميكرولتر من كاشف التعدي مع 100 ميكرولتر من MEM. احتضان كلا الخليطين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم اخلطي الخلطات وأضيفي 400 ميكرولتر من MEM منخفض المصل.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا المحتضنة مرتين بأجزاء سعة ملليلتر واحد من DMEM الخالي من المصل. وزعي خليط التعداء سعة 600 ميكرولتر في آبار اللوحة المكونة من 12 بئرا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

ثم قم بإزالة الوسيط ، واغسل الخلايا مرتين بأجزاء سعة ملليلتر واحد من DMEM. توزيع مليلتر واحد من محلول N-azidoacetyl-manosamine رباعي الأسيتلات بين الآبار في DMEM. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة يومين.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا وتزييفها وأعد زراعتها في طبق متحد البؤر طوال الليل. بعد ذلك ، استبدل الوسيط بمليلتر واحد من DMEM الطازج الذي يحتوي على ميكرولترين من محلول 50 ملليغرام لكل مليلتر من DBCO-UCNs. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام DMEM.

أطفئ ضوء غطاء الدخان وأضف محاليل العازلة المناسبة للخلايا لتصوير الكالسيوم ، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام. اغسل الخلايا باستخدام DMEM الخالي من المصل. قم بإشعاع الخلايا بضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة من 808 نانومتر الذي يوفر 0.8 واط لكل سنتيمتر مربع.

قم بتبديل خمس دقائق من التشعيع مع فترات راحة مدتها خمس دقائق حتى يتم تشعيع الخلايا لمدة 20 دقيقة. صور الخلايا بمجهر متحد البؤر. أظهر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ل UCNs الأساسية والقشرة الأساسية هياكل كروية بسماكة غلاف تبلغ حوالي خمسة نانومتر.

أظهر TEM عالي الدقة تباعدا متسقا مع الهياكل النانوية عالية التبلورة. بعد تعديل السطح ، تم تشتيت UCNs بسهولة في محلول عازل. يشير تشتت الضوء الديناميكي إلى أن القطر الهيدروديناميكي ل DBCO-UCNs في المحلول المائي يبلغ حوالي 96 نانومتر.

تشير إمكانات زيتا ل PAA و DBCO إلى أسطح سالبة الشحنة ، وهو ما يتوافق مع الذوبان والاستقرار في المحاليل العازلة المائية. أظهرت اختبارات الانبعاث المحولة أن شبكات UCN المعدلة بواسطة PAA و DBCO لها نفس أنماط الانبعاث مثل UCNs ذات الغلاف الأساسي عند تعريضها للإشعاع بضوء 808 نانومتر. تم استخدام خلايا HEK293 الموسومة من Azide والتي تعبر عن بروتينات القناة ذات البوابات الضوئية لاختبار التطبيقات الحيوية ل DBCO-UCNs.

يعزى توطين UCNs في علامات الأزيد إلى تلطيخ مجموعات DBCO بصبغة تحتوي على أزيد. عندما تعرضت هذه الخلايا لضوء الأشعة تحت الحمراء القريبة ، سهلت DBCO-UCNs تدفق أيونات الكالسيوم عبر غشاء الخلية ، كما هو موضح في التصوير متحد البؤر وقياس التدفق الخلوي باستخدام مؤشر الكالسيوم الفلوري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير البلورات النانوية ذات التحويل الرأسي مع تعديل السطح المتوافق حيويا وتطبيقاتها الحيوية الإضافية لتنشيط القناة الأيونية ذات البوابات الضوئية في الخلايا الحية باتباع هذا الإجراء.