التجهيز لانسجة القلب البشري تجاه المصفوفة خارج الخلية التي ذاتية تجميع المائية في المختبر و في فيفو التطبيقات

الهدف العام من هذا الإجراء هو معالجة مصفوفة القلب خارج الخلية إلى هيدروجيل ، مما يتيح دراسة تأثير المصفوفة في المقايسات المختلفة القائمة على الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال القلب ، مثل كيفية تأثير المصفوفة خارج الخلية على سلوك الخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل استخدام المصفوفة خارج الخلية لإجراء تجارب واسعة النطاق في المختبر أو في الجسم الحي.

يمكن توسيع تطبيقات هذه التقنية نحو علاج احتشاء عضلة القلب لأن المصفوفة يمكن أن توفر إشارات البقاء على قيد الحياة. لبدء التجربة ، استخدم مشرطا معقما بشفرة رقم عشرة ، لإزالة الأنسجة الدهنية من عضلة القلب البطين الأيسر التي تم الحصول عليها مسبقا. قطع عضلة القلب إلى مكعبات حوالي 1 × 1 × 1 سم باستخدام مشرط.

بعد ذلك ، ضع المكعبات في أنبوب معقم سعة 50 مل. قم بتخزين الأنابيب التي تحتوي على المكعبات عند 80 درجة مئوية. أخرج الأنبوب الذي يحتوي على المكعبات المحضرة من الفريزر وانقله على الثلج إلى ناظم البرد.

اضبط درجة حرارة الجسم والغرفة في ناظم البرد على 15 درجة مئوية. قم بتبريد الأنابيب والطوابع الفارغة سعة 50 مل في الغرفة. أضف طبقة من وسط القطع بالتبريد على الختم البارد ، واتركه يتجمد حتى يصبح أبيض وصلبا.

أضف طبقة ثانية من وسط القطع بالتبريد ، وضع أنبوب عضلة القلب في الطبقة الثانية. تأكد من تجميد وسط القطع بالتبريد وعضلة القلب تماما. ثم أدخل الختم بعضلة القلب المجمدة في الحامل وشد جميع البراغي.

قم بقص سطح الأنسجة حتى يتم الحصول على سطح تقطيع متساو. قسم عضلة القلب المجمدة مع التقسيم التلقائي لضمان أقسام قطع موحدة. يمكن تقطيع ما يقرب من 30 إلى 40 قسما من مكعب واحد.

ضع كل شريحة ، بعد التقسيم ، بشكل غير محكم في أنبوب 50 مل مبرد مسبقا. أغلق الأنابيب المملوءة وضعها على الثلج. انقل الأجزاء المجمدة من جميع الأنابيب سعة 50 مل إلى دورق واحد معقم.

أضف 50 مل من محلول التحلل لكل أنبوب سعة 50 مل يحتوي على شرائح عضلة القلب. بعد ذلك ، رج شرائح عضلة القلب في دورق معقم. صفي السائل بشرائح المناديل من خلال مصفاة خشنة.

ثم انقل شرائح الأنسجة بملاقط حادة إلى دورق معقم جديد. أضف 50 مل من 0.5٪ SDS في PBS لكل أنبوب أولي سعة 50 مل من شرائح عضلة القلب. رج الدورق باستمرار لمدة ست ساعات عند 100-150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الرج ، صفي السائل بشرائح المناديل من خلال مصفاة خشنة. باستخدام ملقط غير حاد ، انقل شرائح المناديل إلى دورق معقم جديد واغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام 50 مل من PBS. بعد ذلك ، اغسل الشرائح طوال الليل في PBS ، باستخدام 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ نيستاتين.

في اليوم التالي، قم بإزالة محلول الغسيل، وأضف 25 مل من FBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1٪ نيستاتين، إلى الشرائح منزوعة الخلايا لكل أنبوب أولي سعة 50 مل من شرائح عضلة القلب. احتضان الشرائح لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية لإزالة أي حمض نووي متبقي من المصفوفة. ثم انقل الشرائح إلى دورق معقم جديد واغسلها ثلاث مرات باستخدام 50 مل من PBS.

ضع شرائح ECM بشكل غير محكم في طبق جديد معقم من ستة آبار. قم بتجميد ECM عند 80 درجة مئوية ، وقم بتجميد الميكروبات لمدة يومين في تجميد الشعر. لسحق شريحة ECM ، استخدم أنابيب الطحن التي تحتوي على حبات خزفية مقاس 1.4 مم.

املأ الأنابيب بشكل غير محكم باستخدام ECM المجفف بالتجميد ، باستخدام ملاقط معقمة غير حادة. قم بتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل. أدخل الأنابيب المجمدة في آلة الطحن وسحق وحدة التحكم في المحرك (ECM).

اضبط المدة على 30 ثانية ، واضبط السرعة القصوى ، وابدأ تشغيل الجهاز. بعد السحق ، أخرج الأنابيب ، وقم بتجميدها مرة أخرى في النيتروجين السائل. اغسل الجسيمات الدقيقة من الأنابيب ، عن طريق إضافة 1 مل من ddH20 لكل أنبوب ، ورجها للذوبان الكامل.

بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول غير المتجانس من خلال شبكة 200 ميكرومتر ، في أنبوب سعة 50 مل. قم بتجميد الأنبوب في النيتروجين السائل. استبدل الغطاء القياسي للأنبوب بفلتر 0.22 ميكرومتر لمنع المسحوق من التدفق خارج الأنبوب.

أدخل الأنبوب في المجفف بالتجميد ، وقم بتجميده مرة أخرى لإزالة الماء من خطوة الغسيل. قم بإذابة مسحوق ECM البشري المجفف بالتجميد مسبقا في محلول البيبسين ، إلى تركيز نهائي يبلغ 10 مجم لكل مل. انقل المحلول إلى أنابيب 2 مل بحجم 1 مل لكل أنبوب.

ماصة المحلول للخلط جيدا. بعد ذلك ، ضع الأنابيب في الخلاط ورجها عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة 48 ساعة عند 27 درجة مئوية. أخرج الأنابيب من الخلاط وضعها على الثلج أو حامل أنبوب مبرد مسبقا.

امزج 1/9 من حجم محلول ECM البارد 10X PBS ، مع 1/10 من حجم محلول ECM من هيدروكسيد الصوديوم البارد 0.1 مولار ، في أنبوب مبرد مسبقا وضعه على الجليد لتحييد محلول ECM المهضوم وتعطيل البيبسين. أخيرا، أضف محلول ECM إلى خليط التحييد واخلطه جيدا من خلال سحب العينات أو الدوامة. كشفت المقايسات الكمية لمكونات ECM الفردية عن إزالة أكثر اكتمالا للحمض النووي والحفاظ بشكل أفضل على الكولاجين الكلي والإيلاستين والجليكوزومينوجليكان مقارنة بإزالة الخلايا بواسطة SDS وحده.

تم استخدام RT-PCR لتحديد التعبير عن بروتينات عضلة القلب الهيكلية ، وعوامل نسخ عضلة القلب المبكرة والمتأخرة ، وجينات علامات سطح الخلايا البطانية في Musine ESC ، التي تخضع للتمايز التلقائي. يؤدي التلامس مع cECM إلى دفع الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ويفضل أن يكون ذلك نحو عضلة القلب مثل النمط الظاهري. يوضح الفحص المجهري الضوئي لتباين الطور أن الهضم الأنزيمي ل cECM لمدة 48 ساعة ، ينتج عنه محلول ECM أكثر تجانسا.

التلوين الحي / الميت للأرومات الليفية القلبية البشرية على هيدروجيل cECM زيادة في الجدوى. تعمل كل من الجسيمات الدقيقة cECM و cECM hydrogel على تعزيز النشاط الأيضي لخلايا HL-1 المقلصة ، في الظروف الإقفارية ، مقارنة بالخلايا في الثقافة القياسية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أسبوع واحد من الأنسجة إلى الهيدروجيل ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد القلب ، لاستكشاف تأثيرات مصفوفة القلب خارج الخلية ، في المختبر وفي الجسم الحي ، الأنظمة النموذجية.