اختبار الهجرة Transwell
تعد هجرة الخلايا استجابة للإشارات الكيميائية أمرا بالغ الأهمية للتطور والمناعة والحالات المرضية مثل السرطان. لتحديد هجرة الخلايا ، تم تطوير اختبار بسي…
اختبار الهجرة عبر الويل هو تقنية كلاسيكية تسمح للعلماء بتحديد حركة الخلايا. يشير الترحيل إلى قدرة الخلية على التحرك بشكل فردي أو في مجموعات. أصبحت حركات الخلايا ممكنة من خلال إعادة الهيكل الدقيق للهيكل الخلوي وعادة ما تحدث الهجرة استجابة للمنبهات التي تعمل كإشارات.
اليوم ، سنناقش مقايسة الهجرة عبر الويل ، والتي تستخدم إعداد غرفة بسيط لتقييم الهجرة استجابة لجذب الإشارات.
سنبدأ بتقديم بعض المعلومات الأساسية عن غرفة ترانسويل.
تم تصميم الجهاز لأول مرة من قبل الدكتور ستيفن بويدن في عام 1961 ، الذي استخدمه لدراسة هجرة الكريات البيض. لذلك ، تعرف هذه الطريقة أيضا باسم مقايسة غرفة بويدن.
في غرفة بويدن البسيطة ، يكون الجدار الخارجي من الآبار ، مثل تلك الموجودة في صفيحة 96 بئرا. داخل كل بئر ، يتم وضع بئر ، وهو عبارة عن إدراج أسطواني. يحتوي الملحق على غشاء من البولي كربونات بحجم مسام محدد. عند وضعها في البئر ، فإنها تقسم الغرفة إلى قسمين. المقصورة العلوية هي المكان الذي سيتم فيه زرع الخلايا التي سيتم دراسة سلوكها المهاجر ، والخزان السفلي هو المكان الذي يتم فيه وضع محلول الجاذب الكيميائي. بحكم التعريف ، فإن الجاذب الكيميائي هو جزيء لديه القدرة على تعزيز حركة الخلية عن طريق "جذب الخلايا".
بسبب هذه القوى الجذابة ، تهاجر الخلايا الموجودة في المقصورة العلوية عبر المسام إلى الخزان السفلي. إذا كانت الخلايا لها خصائص ملتصقة ، مثل بعض خلايا الورم الميلانيني ، فبعد الحركة "ستلتصق" بالجانب السفلي من الغشاء. في هذه الحالة ، يمكن إصلاح الغشاء وتلطيخه ويمكن عد الخلايا تحت المجهر. من ناحية أخرى ، فإن الخلايا غير الملتصقة ، مثل المنوية ، ستنتقل إلى الخزان السفلي. في هذه الحالة ، يمكن حساب الخلايا الموجودة في محلول الخزان بمساعدة مقياس الدم.
على الرغم من أن إعداد هذا الاختبار بسيط ، إلا أن هناك العديد من الأشياء التي تحتاج إلى مراعاتها قبل التجربة. دعنا نراجع بعضا منهم.
بدءا من حل البذر ، عليك التأكد من تحسين الكثافة لمراقبة هجرة الخلايا. يمكن أن يؤدي عدد قليل جدا من الخلايا إلى هجرة غير قابلة للكشف ، وستؤدي الكثافة الأكبر إلى زيادة ملء الغشاء ، مما يجعل من الصعب تعداد الهجرة. الاعتبار الثاني هو حجم مسام الإدراج. يجب اختياره بعناية حسب نوع الخلية. إذا كان حجم المسام صغيرا جدا ، فلن تتمكن الخلايا من المرور.
بدلا من ذلك ، إذا كان حجم المسام كبيرا جدا ، فسوف تسقط الخلايا ، وهي ليست هجرة. أخيرا ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره تركيز الجاذب الكيميائي ووقت الحضانة المسموح به للهجرة ، حيث أنهما يعتمدان بعضهما البعض. التركيز الأمثل مع وقت الحضانة المناسب الذي يتم خلاله الحفاظ على تدرج التركيز بين المقصورات ، يحفز هجرة الخلايا بسبب الجذب الكيميائي. على العكس من ذلك ، قد تكون الحضانات المطولة مصحوبة بتوازن الجاذب الكيميائي في جميع أنحاء الغرفة مما يؤدي إلى فقدان التدرج الكيميائي ، مما قد يربك تحليل النتائج التي تم الحصول عليها.
مع وضع هذه الاعتبارات في الاعتبار ، دعنا نناقش بروتوكولا يستخدم لقياس هجرة الخلايا الملتصقة.
يتم تحضير الخلايا المراد فحصها في وسط خال من البروتياز ، حيث يمكن للبروتياز أن يفسد مستقبلات الغشاء المهمة ، ويؤثر في النهاية على الهجرة. بعد تحضير الخلايا ، يجب تخفيف المعلق إلى كثافة البذر المثلى. من أجل تحضير الغرفة ، يتم وضع الآبار في آبار على صفيحة متعددة الآبار. يجب سحب تعليق الخلية في البئر دون لمس الغشاء أو إدخال فقاعات الهواء.
يتم سحب محلول الجاذب الكيميائي في الخزان السفلي ، مع التأكد من أن المحلول يلامس غشاء الملحق. سيعتمد وقت حضانة الهجرة على الاعتبارات التجريبية. بعد الحضانة ، يتم تثبيت الأغشية عن طريق غمس الملحق في 70٪ من الإيثانول. بعد ترك الملحق يجف ، يضاف محلول تلطيخ الخلية.
بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، يتم غسل الإدخالات بمساعدة مخزن الغسيل المؤقت. أخيرا ، يمكن استئصال الغشاء ووضعه على شريحة مجهرية. تمثل الخلايا الموجودة على الجانب السفلي من الغشاء عدد الخلايا التي هاجرت في وجود وغياب الجاذبات الكيميائية.
نظرا لأن لديك الآن شعورا بالبروتوكول ، دعنا نلقي نظرة سريعة على كيفية استخدام الباحثين لهذه الطريقة في استكشافاتهم.
أحد التطبيقات الأكثر شيوعا لهذا الاختبار هو تقييم خصائص الجاذب الكيميائي للمركبات غير المعروفة. هنا ، كان العلماء مهتمين بفحص مسارات السباحة للحيوانات المنوية من الضفادع في وجود الألورين ، وهي مادة تفرزها بيض البرمائيات. للقيام بذلك ، قاموا أولا بسحب المنوية النشطة من الضفادع إلى الجزء العلوي من إدخالات الخطوط السريعة. إلى الأسفل ، أضافوا الألورین. بعد السماح للخلايا بالهجرة ، قاموا بإحصاء المنوية في محلول الخزان تحت المجهر. باستخدام هذه التقنية ، تمكنوا من إنشاء منحنى استجابة التركيز الذي يصور تأثير تركيز الألوران على هجرة المنوية.
عندما تتعرض الخلية للهجوم من قبل مسببات الأمراض ، فإنها ترسل جاذبات كيميائية لتجنيد الخلايا المناعية التي تهاجر وتربط وتحلها العدوى لاحقا. لاختبار هذه الظاهرة ، قام هؤلاء العلماء بزراعة الخلايا الظهارية على الجانب السفلي من الإدخالات. بعد ذلك ، أصابوا هذه الخلايا بسلالات مختلفة من البكتيريا. أخيرا ، أدخلوا الخلايا المناعية في الغرفة العلوية. من المعروف أن الخلايا المصابة تنتج العديد من الجاذبات الكيميائية التي تحفز على هجرة الخلايا المناعية. أظهرت نتائج هذه التجربة درجات مختلفة من هجرة العدلات استجابة لأنواع مختلفة من العدوى البكتيرية.
أخيرا ، لطالما أثار غزو الخلايا السرطانية والورم الخبيث من خلال المصفوفة خارج الخلية اهتمام علماء الأحياء الخلوية. هنا ، أراد العلماء تحديد كيف يمكن أن تساهم عوامل الجذب الكيميائي المحددة في مثل هذه الهجرة من خلال مصفوفة ثلاثية الأبعاد. قاموا بهندسة مجموعتين منفصلتين من الخلايا: أحدهما يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر والآخر الفلورسنت الأحمر. ثم قاموا بسحب مصفوفة خارج الخلية إلى الجزء العلوي من الآبار.
بمجرد التصلب ، قاموا بعكس البئر وزرع مجموعتين من الخلايا على الجانب السفلي من الغشاء. بعد ذلك ، استبدلوا الملحق في اللوحة متعددة الآبار وقاموا بسحب محلول الجاذب الكيميائي في الغرفة العلوية. تسبب هذا في تحرك الخلايا الموجودة في الأسفل لأعلى ومن خلال المصفوفة ثلاثية الأبعاد. بمساعدة التصوير متحد البؤر ، أعاد هؤلاء الباحثون بناء هجرة الخلايا في 3D ، وتميزوا أنماط الهجرة لمجموعتين من الخلايا.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول مقايسة ترحيل transwell. من خلال فهم مكونات وبروتوكول هذه الطريقة ، فأنت تعرف الآن سبب استخدامها على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء الخلوية. على الرغم من بساطة هذا الإعداد ، فإن مجموعة التكوينات التي يمكن أن تتكيف معها هذه الطريقة تجعلها لا غنى عنها لدراسات حركة الخلايا. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
اختبار الهجرة عبر الويل هو تقنية كلاسيكية تسمح للعلماء بتحديد حركة الخلايا. يشير الترحيل إلى قدرة الخلية على التحرك بشكل فردي أو في مجموعات. أصبحت حركات الخلايا ممكنة من خلال إعادة الهيكل الدقيق للهيكل الخلوي وعادة ما تحدث الهجرة استجابة للمنبهات التي تعمل كإشارات.
اليوم ، سنناقش مقايسة الهجرة عبر الويل ، والتي تستخدم إعداد غرفة بسيط لتقييم الهجرة استجابة لجذب الإشارات.
سنبدأ بتقديم بعض المعلومات الأساسية عن غرفة ترانسويل.
تم تصميم الجهاز لأول مرة من قبل الدكتور ستيفن بويدن في عام 1961 ، الذي استخدمه لدراسة هجرة الكريات البيض. لذلك ، تعرف هذه الطريقة أيضا باسم مقايسة غرفة بويدن.
في غرفة بويدن البسيطة ، يكون الجدار الخارجي من الآبار ، مثل تلك الموجودة في صفيحة 96 بئرا. داخل كل بئر ، يتم وضع بئر ، وهو عبارة عن إدراج أسطواني. يحتوي الملحق على غشاء من البولي كربونات بحجم مسام محدد. عند وضعها في البئر ، فإنها تقسم الغرفة إلى قسمين. المقصورة العلوية هي المكان الذي سيتم فيه زرع الخلايا التي سيتم دراسة سلوكها المهاجر ، والخزان السفلي هو المكان الذي يتم فيه وضع محلول الجاذب الكيميائي. بحكم التعريف ، فإن الجاذب الكيميائي هو جزيء لديه القدرة على تعزيز حركة الخلية عن طريق "جذب الخلايا".
بسبب هذه القوى الجذابة ، تهاجر الخلايا الموجودة في المقصورة العلوية عبر المسام إلى الخزان السفلي. إذا كانت الخلايا لها خصائص ملتصقة ، مثل بعض خلايا الورم الميلانيني ، فبعد الحركة "ستلتصق" بالجانب السفلي من الغشاء. في هذه الحالة ، يمكن إصلاح الغشاء وتلطيخه ويمكن عد الخلايا تحت المجهر. من ناحية أخرى ، فإن الخلايا غير الملتصقة ، مثل المنوية ، ستنتقل إلى الخزان السفلي. في هذه الحالة ، يمكن حساب الخلايا الموجودة في محلول الخزان بمساعدة مقياس الدم.
على الرغم من أن إعداد هذا الاختبار بسيط ، إلا أن هناك العديد من الأشياء التي تحتاج إلى مراعاتها قبل التجربة. دعنا نراجع بعضا منهم.
بدءا من حل البذر ، عليك التأكد من تحسين الكثافة لمراقبة هجرة الخلايا. يمكن أن يؤدي عدد قليل جدا من الخلايا إلى هجرة غير قابلة للكشف ، وستؤدي الكثافة الأكبر إلى زيادة ملء الغشاء ، مما يجعل من الصعب تعداد الهجرة. الاعتبار الثاني هو حجم مسام الإدراج. يجب اختياره بعناية حسب نوع الخلية. إذا كان حجم المسام صغيرا جدا ، فلن تتمكن الخلايا من المرور.
بدلا من ذلك ، إذا كان حجم المسام كبيرا جدا ، فسوف تسقط الخلايا ، وهي ليست هجرة. أخيرا ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره تركيز الجاذب الكيميائي ووقت الحضانة المسموح به للهجرة ، حيث أنهما يعتمدان بعضهما البعض. التركيز الأمثل مع وقت الحضانة المناسب الذي يتم خلاله الحفاظ على تدرج التركيز بين المقصورات ، يحفز هجرة الخلايا بسبب الجذب الكيميائي. على العكس من ذلك ، قد تكون الحضانات المطولة مصحوبة بتوازن الجاذب الكيميائي في جميع أنحاء الغرفة مما يؤدي إلى فقدان التدرج الكيميائي ، مما قد يربك تحليل النتائج التي تم الحصول عليها.
مع وضع هذه الاعتبارات في الاعتبار ، دعنا نناقش بروتوكولا يستخدم لقياس هجرة الخلايا الملتصقة.
يتم تحضير الخلايا المراد فحصها في وسط خال من البروتياز ، حيث يمكن للبروتياز أن يفسد مستقبلات الغشاء المهمة ، ويؤثر في النهاية على الهجرة. بعد تحضير الخلايا ، يجب تخفيف المعلق إلى كثافة البذر المثلى. من أجل تحضير الغرفة ، يتم وضع الآبار في آبار على صفيحة متعددة الآبار. يجب سحب تعليق الخلية في البئر دون لمس الغشاء أو إدخال فقاعات الهواء.
يتم سحب محلول الجاذب الكيميائي في الخزان السفلي ، مع التأكد من أن المحلول يلامس غشاء الملحق. سيعتمد وقت حضانة الهجرة على الاعتبارات التجريبية. بعد الحضانة ، يتم تثبيت الأغشية عن طريق غمس الملحق في 70٪ من الإيثانول. بعد ترك الملحق يجف ، يضاف محلول تلطيخ الخلية.
بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، يتم غسل الإدخالات بمساعدة مخزن الغسيل المؤقت. أخيرا ، يمكن استئصال الغشاء ووضعه على شريحة مجهرية. تمثل الخلايا الموجودة على الجانب السفلي من الغشاء عدد الخلايا التي هاجرت في وجود وغياب الجاذبات الكيميائية.
نظرا لأن لديك الآن شعورا بالبروتوكول ، دعنا نلقي نظرة سريعة على كيفية استخدام الباحثين لهذه الطريقة في استكشافاتهم.
أحد التطبيقات الأكثر شيوعا لهذا الاختبار هو تقييم خصائص الجاذب الكيميائي للمركبات غير المعروفة. هنا ، كان العلماء مهتمين بفحص مسارات السباحة للحيوانات المنوية من الضفادع في وجود الألورين ، وهي مادة تفرزها بيض البرمائيات. للقيام بذلك ، قاموا أولا بسحب المنوية النشطة من الضفادع إلى الجزء العلوي من إدخالات الخطوط السريعة. إلى الأسفل ، أضافوا الألورین. بعد السماح للخلايا بالهجرة ، قاموا بإحصاء المنوية في محلول الخزان تحت المجهر. باستخدام هذه التقنية ، تمكنوا من إنشاء منحنى استجابة التركيز الذي يصور تأثير تركيز الألوران على هجرة المنوية.
عندما تتعرض الخلية للهجوم من قبل مسببات الأمراض ، فإنها ترسل جاذبات كيميائية لتجنيد الخلايا المناعية التي تهاجر وتربط وتحلها العدوى لاحقا. لاختبار هذه الظاهرة ، قام هؤلاء العلماء بزراعة الخلايا الظهارية على الجانب السفلي من الإدخالات. بعد ذلك ، أصابوا هذه الخلايا بسلالات مختلفة من البكتيريا. أخيرا ، أدخلوا الخلايا المناعية في الغرفة العلوية. من المعروف أن الخلايا المصابة تنتج العديد من الجاذبات الكيميائية التي تحفز على هجرة الخلايا المناعية. أظهرت نتائج هذه التجربة درجات مختلفة من هجرة العدلات استجابة لأنواع مختلفة من العدوى البكتيرية.
أخيرا ، لطالما أثار غزو الخلايا السرطانية والورم الخبيث من خلال المصفوفة خارج الخلية اهتمام علماء الأحياء الخلوية. هنا ، أراد العلماء تحديد كيف يمكن أن تساهم عوامل الجذب الكيميائي المحددة في مثل هذه الهجرة من خلال مصفوفة ثلاثية الأبعاد. قاموا بهندسة مجموعتين منفصلتين من الخلايا: أحدهما يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر والآخر الفلورسنت الأحمر. ثم قاموا بسحب مصفوفة خارج الخلية إلى الجزء العلوي من الآبار.
بمجرد التصلب ، قاموا بعكس البئر وزرع مجموعتين من الخلايا على الجانب السفلي من الغشاء. بعد ذلك ، استبدلوا الملحق في اللوحة متعددة الآبار وقاموا بسحب محلول الجاذب الكيميائي في الغرفة العلوية. تسبب هذا في تحرك الخلايا الموجودة في الأسفل لأعلى ومن خلال المصفوفة ثلاثية الأبعاد. بمساعدة التصوير متحد البؤر ، أعاد هؤلاء الباحثون بناء هجرة الخلايا في 3D ، وتميزوا أنماط الهجرة لمجموعتين من الخلايا.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول مقايسة ترحيل transwell. من خلال فهم مكونات وبروتوكول هذه الطريقة ، فأنت تعرف الآن سبب استخدامها على نطاق واسع من قبل علماء الأحياء الخلوية. على الرغم من بساطة هذا الإعداد ، فإن مجموعة التكوينات التي يمكن أن تتكيف معها هذه الطريقة تجعلها لا غنى عنها لدراسات حركة الخلايا. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the transwell migration assay and why is it used in cell biology?
The transwell migration assay, also called the Boyden chamber assay, is a classical technique designed in 1961 to quantify cell movement in response to chemical cues. It uses a simple chamber setup with a polycarbonate membrane separating two compartments. Scientists seed cells in the top chamber and place chemoattractant solution below, then count migrated cells to measure cell motility and cell invasion and chemo attraction responses.
Q2: How does the transwell chamber separate cells and chemoattractants?
The transwell chamber consists of a cylindrical insert with a polycarbonate membrane of defined pore size placed inside a multiwell plate well. This membrane divides the chamber into two compartments: the top compartment holds cells to be studied, and the bottom reservoir contains chemoattractant solution. Cells migrate through the membrane pores toward the attracting chemical gradient in the lower compartment.
Q3: What factors must be optimized before running a transwell migration assay?
Three critical factors require optimization: cell seeding density must be balanced to detect migration without overpopulation; pore size must match the cell type so cells can pass through without falling through; and chemoattractant concentration with appropriate incubation time must maintain a chemical gradient. Prolonged incubation can equilibrate the chemoattractant throughout the chamber, eliminating the gradient and confounding results.
Q4: How are adherent cells counted after migration in a transwell assay?
After incubation, the transwell membrane is fixed by dipping the insert into 70% ethanol and allowed to dry. Cell staining solution is then applied for approximately 30 minutes at room temperature. Following washing with buffer, the membrane is excised and placed on a microscope slide. Cells on the membrane's underside represent those that migrated and can be counted microscopically.
Q5: Why is protease-free medium used when preparing cells for the transwell assay?
Protease-free medium is essential because proteases can denature important membrane receptors that are critical for cell migration. Damaged receptors would impair the cell's ability to respond to chemoattractant signals, compromising the accuracy of migration measurements and potentially underestimating or misrepresenting the cell's true migratory capacity.
Q6: What are common research applications of the transwell migration assay?
Researchers use the transwell assay to evaluate chemoattractant properties of unknown compounds, test immune cell recruitment in response to infection, and study cancer cell invasion through extracellular matrices. The assay's adaptability allows scientists to examine migration in various contexts, from simple 2D membrane assays to complex 3D matrix invasion studies using fluorescent cell tracking.
Q7: How do adherent and non-adherent cells differ in transwell migration assays?
Adherent cells, like melanoma cells, stick to the membrane's underside after migration and are counted by fixing, staining, and microscopic observation of the membrane. Non-adherent cells, like sperm, migrate into the bottom reservoir solution and are counted using a hemocytometer. The counting method depends on the cell type's inherent adhesive properties.