متعدد سيتوكين التنميط من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام منصة المستندة إلى حبة سيتوميتريك المناعة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد أهداف السيتوكين المتعددة في وقت واحد في المواد الطافية لزراعة الأنسجة التي تم جمعها من خلايا طحال الفئران المحفزة باستخدام مقايسة مناعية قائمة على الخرزة متعددة الإرسال ومقياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل ، ما هي ملامح السيتوكين الفريدة التي تنسق الاستجابة المناعية في سياق حالات مرضية معينة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القياس الكمي المتزامن للحلقيات المتعددة التي يمكن إجراؤها باستخدام أحجام عينات أقل بكثير من تنسيقات ELISA التقليدية مع تقليل الربط غير المحدد في نفس الوقت.

سيوضح هذا الإجراء نيكولاس جونسن ، باحث مشارك من فريق تطوير المنتجات لدينا. ابدأ هذا الإجراء بإعداد العينة البيولوجية كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير الخرز الثابت بالأجسام المضادة الممزوجة مسبقا ، قم بصوتنة زجاجة الخرز المخلوطة مسبقا لمدة دقيقة واحدة في حمام صوتي في درجة حرارة الغرفة.

ثم دوامة لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام. إذا لم يكن هناك حمام صوتي متاح ، فقم بزيادة وقت الدوامة إلى دقيقة واحدة. للتحضير القياسي ، أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص لإعادة تكوين كوكتيل Mouse Th Cytokine Standard المجفف.

امزج عن طريق الدوامة لفترة وجيزة ، واترك القارورة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. انقل الكوكتيل القياسي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبلين تحمل علامة C7. سيتم استخدام هذا كأعلى معيار. قم بتسمية ستة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبلين على أنها C1 إلى C6. أضف 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص لكل من هذه الأنابيب.

بعد ذلك ، انقل 25 ميكرولترا من المعيار الأعلى ، C7 ، إلى أنبوب C6 ، واخلطه جيدا عن طريق الدوامة. سيكون هذا هو معيار C6. استمر في إجراء عمليات تخفيف تسلسلية من واحد إلى أربعة ، باستخدام طرف ماصة جديد لكل أنبوب لإضافة 25 ميكرولترا من المعيار السابق إلى 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص في أدنى أنبوب قياسي تالي.

اتبع كل إضافة عن طريق الدوامة. استخدم المخزن المؤقت للفحص باعتباره معيار صفر بيكوغرام لكل مليلتر. لإجراء الفحص ، اترك جميع الكواشف تسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

تستخدم ألواح ترشيح البولي بروبلين في هذا العرض التوضيحي. من الضروري للغاية أن تظل اللوحة منتصبة أثناء إجراء الفحص بأكمله ، بما في ذلك خطوات الغسيل ، لتجنب فقدان الخرز. قم بترطيب ورق الترشيح مسبقا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1X إلى كل بئر ، واترك الأطباق لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة حجم المخزن المؤقت باستخدام مشعب التفريغ. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة عن طريق الضغط على اللوحة على كومة من المناشف الورقية النظيفة. ثم ضع اللوحة فوق غطاء اللوحة المقلوب.

بالنسبة لعينات الطاف لزراعة الخلايا ، أضف 25 ميكرولترا من مخزن الفحص إلى جميع الآبار. أضف 25 ميكرولترا من كل معيار إلى الآبار القياسية. أخيرا ، أضف 25 ميكرولترا من كل عينة إلى آبار العينة.

دوامة الخرز المختلطة لمدة 30 ثانية. ثم أضف 25 ميكرولترا من الخرزات المختلطة إلى كل بئر ، مع رج زجاجة الخرزة بشكل متقطع لتجنب استقرار الخرزة. أغلق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب من الألواح.

بمجرد إغلاقها ، لف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم. ضع اللوحة على شاكر اللوحة ، وثبتها ، ورجها عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بدون قلب ، ضع اللوحة على مشعب الفراغ وقم بتطبيق الفراغ كما كان من قبل.

ثم أضف 200 ميكرولتر من مخزن غسيل 1X إلى كل بئر. قم بإزالة محتويات آبار لوحة الفحص عن طريق الترشيح الفراغي. امسح عازلة الغسيل الزائدة من أسفل اللوحة باستخدام وسادة ماصة أو مناشف ورقية قبل تكرار هذه الخطوة مرة أخرى.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر. بعد إغلاق اللوحة باستخدام مادة مانعة للتسرب جديدة ، قم بلف اللوحة بأكملها ، بما في ذلك غطاء اللوحة المقلوب ، بورق الألمنيوم. ضع الطبق على شاكر اللوحة ورجه بسرعة 500 دورة في الدقيقة تقريبا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بدون تنظيف بالمكنسة الكهربائية ، أضف 25 ميكرولترا من كاشف الستربتافيدين فيكوريثيرين مباشرة إلى كل بئر. أغلق الطبق ولفه كما كان من قبل. بعد ذلك ، ضع الطبق على شاكر الطبق ورجه عند حوالي 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد تكرار خطوة الترشيح الفراغي مرتين ، أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل 1X إلى كل بئر. أعد تعليق الخرزات على شاكر الطبق لمدة دقيقة واحدة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، انقل العينات من لوحة المرشح إلى أنابيب FACS لقراءة العينات على مقياس التدفق الخلوي.

ابدأ تشغيل مقياس التدفق الخلوي وبرنامج الاستحواذ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة المتوفرة مع الجهاز. قم بإنشاء مخطط نقطي مع مبعثر أمامي على المحور X ومبعثر جانبي للمحور Y. اضبط المبعثر الأمامي والمبعثر الجانبي على الوضع الخطي.

دوامة قارورة الخرز الخام المضمنة في المجموعة لمدة 30 ثانية لإعادة تعليق الخرز. انقل 400 ميكرولتر من الخرزات الخام إلى أنبوب FACS جديد. اضبط معدل تدفق مقياس التدفق الخلوي على منخفض.

قم بتشغيل الخرز الخام ، واضبط الكسب والجهد بعناية للتشتت الأمامي والتشتت الجانبي بحيث يتم فصل كل من حجم هذه الخرزات بشكل واضح ويسهل البوابة. اضبط عتبة التعثر الأمامي لاستبعاد الأحداث غير المرغوب فيها. في مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي ، ارسم بوابة تتضمن جميع مجموعات الخرز.

اعرض مجموعات الخرزة المسورة من مخطط التشتت الأمامي مقابل مخطط التشتت الجانبي على مخطط النقطة الثانية مع PE على المحور X و APC للمحور Y. اضبط جهد PMT لقناة مضان APC بحيث يكون لإشارة APC لجميع مجموعات الخرز متوسط شدة مضان ، أو MFI ، يتراوح بين 10 و 5 ، 000. بعد ذلك ، قم بتدوير قارورة حبات إعداد PE لمدة 30 ثانية لإعادة تعليق الخرز.

انقل 400 ميكرولتر من حبات البولي إيثيلين المعاد تعليقها إلى أنبوب FACS جديد. استبدل أنبوب الخرز الخام في مقياس التدفق الخلوي بأنبوب حبات PE. اضبط جهد أنبوب المضاعف الضوئي لإعداد قناة مضان PE بحيث يقع MFI لخرز PE بين النطاق الخاص بالدفعة الموجود في قارورة حبات PE.

لإجراء الحصول على البيانات ، قم بتعيين عدد أحداث الخرزة التي سيتم الحصول عليها على حوالي 300 لكل أنوليت. دوامة كل عينة لمدة خمس ثوان قبل التحليل. ثم اقرأ العينات.

عند قراءة العينات ، اضبط مقياس التدفق الخلوي على وضع الإعداد أولا ، وانتظر حتى يستقر عدد الخرزة قبل التبديل إلى وضع الاستحواذ. قم بتصدير الأحداث المسورة فقط بدلا من الأحداث الإجمالية قبل إجراء تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. تم إنشاء منحنيات قياسية تمثيلية للأنوليست المستهدفة باستخدام لوحة السيتوكين المساعدة T للماوس.

ستظهر المقايسات التي يتم تشغيلها بشكل صحيح منحنيات ذات نطاقات ديناميكية واسعة كما هو موضح هنا. يجب تشغيل المنحنيات القياسية في كل مرة يتم فيها إجراء الفحص. تم استزراع خلايا طحال الفئران في ظل ظروف مختلفة لمدة 48 ساعة.

تم جمع المواد الطافية للثقافة ، ثم تم قياس تركيزات 13 هدفا باستخدام لوحة السيتوكين المساعدة T للفأر. تظهر ملامح التعبير التفاضلي للسيتوكين ، استجابة لظروف التحفيز ، بوضوح. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال أعمال الطاولة المختبرية لهذه التقنية في أقل من خمس ساعات ونصف إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

ستختلف أوقات الحصول على البيانات والتحليل النهائي اعتمادا على عدد العينات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذا البروتوكول ، وتحديد تركيزات anolyte في العينات البيولوجية باستخدام اختبار مناعي قائم على الخرز. يتضمن ذلك إعداد الكاشف وخطوات الحضانة وإعداد مقياس التدفق الخلوي للحصول على البيانات.