مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

في هذا البروتوكول، نحن تصف التقنيات لتشريح سليم من نبات الزهور وسيليكويس، بعض تقنيات مسح الأساسية، وتحديد تلطيخ إجراءات الملاحظات جبل كل الهياكل الإنجابية.

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح براعم الزهور والزهور والسيليك الصغير بشكل صحيح. والمقاصة اللاحقة للتركيب الكامل لتقنيات التلوين والمراقبة المتنوعة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إنتاج النباتات الجنسية.

مثل التحليل المتحور بشكل مطرد أو أي فشل ناتج عن البيئة والتجريبية في نمو الأزهار ووظيفتها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السماح بالفحص السهل والسريع للعديد من مراحل النمو في وقت واحد. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات تشريح أعضاء الزهرة لأنها تتطلب معرفة مسبقة بمهارات تشريح الأزهار وتشريحها.

للبدء ، استخدم مقصا صغيرا لإزالة الزهور من النباتات المتزامنة. ووضعها على الفور في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الفردية ، التي تحتوي على مثبت مناسب. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت وأضف ما يكفي من الإيثانول بنسبة 70٪ لتغطية العينات بالكامل.

أعد العينات إلى أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل. ثم املأ كوب صانع الساعات بالإيثانول الطازج بنسبة 70٪ وضعه في طبق بتري صغير للحصول على الدعم. ثم ضع الإزهار في زجاج صانع الساعات وتأكد من تغطيته بالكامل بالإيثانول.

باستخدام ملقط وحقنة مجهزة بإبرة ، قم بتشريح الزهرة تحت المجهر الاستريو عن طريق تمزيق الكؤوس والبتلات والأسدية. ثم ضع زجاج صانع الساعات جانبا واستخدم شريحة زجاجية للتشريح النهائي. انقل العينة إلى الانزلاق وأضف 10 ميكرولترات من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪.

قم بعمل جروح على كل جانب من الرسغ ، وتدويره حسب الحاجة. ثم قم بإزالة الصمامات برفق لكشف البويضات. قم بعمل قطع صغير حاد لفصل نصف الأنسجة الناقلة عن الوعاء واستخدم ملقطا وإبرة لتمزيق النصفين.

قم بإزالة نمط وصمة العار والساق بجروح حادة. باستخدام الملقط والإبرة ، اقلب البويضات التي لا تزال متصلة برفق ورتبها للحصول على صفين متوازيين. استخدم قطعة صغيرة من ورق النشاف لإزالة الإيثانول من العينة الموجودة على الشريحة الزجاجية.

ثم أضف 20 ميكرولترا من محلول المقاصة إلى الشريحة. باستخدام زوج من المحاقن مع إبر تحت الجلد ، ضع العينات وقم بإزالة أي فقاعات هواء متبقية. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء برفق على الشريحة وانتظر حتى يملأ محلول المقاصة الفراغ بين زلة الغطاء والعينة.

ضع الشريحة في حامل الشريحة واتركها تحت غطاء الدخان. لذلك دعونا براعم الزهور التي تم حصادها حديثا والتي على وشك الفتح بأنثرات غير متفكة. ثم قم بإعداد طبق 96 جيدا مع محلول ألكسندر كاف لغمر براعم الزهور بالكامل.

قم بإزالة الكؤوس والبتلات لكشف الأنثرات وغمسها في محلول الإسكندر. اترك اللوحة تجلس تحت غطاء الدخان لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. ثم استبدل محلول الإسكندر بمحلول هير المكون من أربعة ونصف واحتضان اللوحة تحت غطاء الدخان طوال الليل.

في اليوم التالي ، استخدم الملقط لنقل البراعم التي تم تطهيرها بعناية إلى شريحة جديدة. بعد ذلك ، قم بتشريح الأسدية وإزالة جميع الأنسجة الأخرى من العينات. ثم استمر في المقاصة القائمة على هيدرات الكلور وتلوين التنظيف المشترك باستخدام محلول Herr المكون من أربعة ونصف.

انقل الزهرة أولا من زجاج صانع الساعات إلى الشريحة واستخدم ورق نشاف لإزالة الإيثانول الزائد. أضف خمسة إلى 10 ميكرولترات من محلول DAPI. باستخدام حقنتين مع إبر تحت الجلد ، قم بتشريح الأسدية وإزالة جميع أعضاء الزهرة الأخرى.

ثم حرر حبوب اللقاح في محلول DAPI. قم بإزالة جميع الحطام من السداة من الشريحة مع التأكد من ترك حبيبات حبوب اللقاح فقط على الشريحة. تعد إزالة جميع حطام السداة من الشريحة الخطوة الأكثر أهمية لإزالة exine.

يجب ترك حبوب اللقاح فقط بين الشريحة وقلة الغطاء. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء على شريحة تحمل العينة وأضف الحد الأدنى من محلول DAPI اللازم لملء الفراغ بين الشريحة وقلة الغطاء. ضع السبابة برفق على زلة الغطاء وقم بحركة انزلاقية قصيرة سريعة.

ضع الشريحة في صندوق بشري في الظلام عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. ثم راقب الشريحة تحت الإزهار الواسع أو الفحص المجهري متحد البؤر في غضون 24 ساعة. انقل العينة المقطوعة من زجاج صانع الساعات إلى صفيحة زجاجية بها تجاويف مملوءة ب 1٪ SDS ومحلول هيدروكسيد الصوديوم 0.2.

احتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. سيقوم محلول هيدروكسيد الصوديوم SDS بمسح العينات بسرعة ، مما يجعلها تبدو شفافة في غضون بضع دقائق. اشطف العينة بالماء بعناية وضعها على شريحة نظيفة.

ثم أضف 20 إلى 40 ميكرولترا من محلول التلوين إلى الشريحة. اعتمادا على العضو الزهري المراد تحليله وعلى مهارات الباحث ، يمكن إجراء علاج DS هذا قبل أو للباحثين ذوي الخبرة أو بعد خطوة التشريح للباحثين الأقل خبرة. بعد ذلك ، ضع زلة غطاء على الشريحة مع الحرص على عدم سحق التحضير.

ثم ضع جميع الشرائح المحضرة في صندوق بشري مغطى بورق الألمنيوم واحتضنه عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. أخيرا ، راقب العينة تحت الإزهار الميداني الواسع أو الفحص المجهري متحد البؤر. بعد إجراء التشريح الموصوف في البروتوكول ، تتم إزالة الأنسجة غير الضرورية التي قد تعيق الملاحظات ويتم الحصول على صور أكثر تفصيلا.

اعتمادا على الهدف ، يمكن استخدام تلطيخ هيدرات الكلور لتوصيف التطور المبكر للزهرة على مستوى برعم الزهرة بالكامل ، والانقسام الاختزالي وتكوين الميكرو في العضو الآخر ، وتطور البويضة المبكر ومواصفات الخلية الأم الضخمة ، أو تطور الأنثى ، أو حتى غزو أنبوب حبوب اللقاح للشبكة المركزية. يتيح تلطيخ الإسكندر الجمع بين تطهير ومقاصة هير أربعة ونصف تقييم إجهاض حبوب اللقاح داخل موضع معين أو آخر ككل. في حين أن حبوب اللقاح القابلة للحياة تظهر سيتوبلازم أحمر ، فإن الحبوب المجهضة تظهر سيتوبلازم فارغا وفي النهاية يتم تشكيلها بشكل غير منتظم وسحقها تماما.

إزالة exine إلى زيادة كثافة تلطيخ النوى وتفاصيل أعلى لتنظيم الكروماتين. استخدام وإزالة هيدروكسيد الصوديوم SDS قبل التلوين جعل الإزهار شفافا. وأدى إلى تلطيخ أعلى للكالوز داخل أنسجة الأزهار.

كشفت عادة ما يصعب رؤية تراكمات كالوز. مثل طبقة كالوز التي تفصل الخلية التوليدية عن الخلية الخضرية. حتى عندما كانت حبوب اللقاح لا تزال موجودة داخل العضو الآخر.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنيات في أقل من 48 ساعة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن النتائج تعتمد إلى حد كبير على إعداد جيد للعينة ، مثل استخدام المثبت المناسب ، وإجراء التشريح بشكل صحيح وعزل الأنسجة ذات الأهمية على الشريحة.