أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

الهدف العام من هذه الطرق هو اكتساب رؤية أعمق حول تأثيرات المعالجة على قدرة العدوى أو سلامة غلاف norovirus البشري. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تعطيل الفيروسات غير المغلفة، مثل ما يحدث لقدرة الغلاف الفيروسي على إصابة الخلية بعد معالجة معينة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطرق في قدرتها على تقديم رؤى ميكانيكية إضافية حول تأثير أي علاج معين على الفيروس. وبالرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول استراتيجيات تعطيل فيروس نورو البشري، إلا أنها تمتلك أيضاً إمكانية التطبيق على فيروسات أخرى غير مغلفة مثل الفيروس الأنفي أو التهاب الكبد A.

للبدء، قم بتخفيف بروتين القفيصة الرئيسي للفيروس النوروي البشري المنقى، والمجمع في قفيصات، بتركيز 50 micrograms لكل milliliter في 1X phosphate buffered saline. استخدم حجماً أقصى قدره 15 microliters في أنابيب PCR الفردية ذات الأغطية.

تأكد من أن الأنبوب يحتوي على 600 nanograms على الأقل من القفيصة (capsid)، وأن هناك 600 nanograms من القفيصة لكل مزيج من الربيطة العلاجية. بعد ذلك، قم بتسخين جهاز الدورات الحرارية مسبقاً إلى درجة حرارة المعالجة الحرارية المطلوبة. ثم، قم بتسخين جهاز دورات حرارية إضافي مسبقاً إلى أربع درجات Celsius للتبريد الفوري.

ضع الأنابيب التي تحتوي على محلول القفيصة في جهاز الدورات الحرارية للمدة المطلوبة. بعد التسخين، انقل الأنابيب فوراً إلى جهاز التبريد المسبق عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. قم بطرد مركزي سريع للأنابيب في جهاز الطرد المركزي لضمان تجميع كافة القطرات في قاع الأنبوب.

قم بتخفيف محاليل الكابسيد المعالجة ومحلول PBS لتصل إلى تركيز 3 µg/mL. تأكد من توفر 200 µL على الأقل من الكابسيد المعالج المخفف. بعد ذلك، ضع 100 µL من محلول الكابسيد في كل بئر، مع التأكد من وجود بئرين على الأقل لكل معاملة. بالإضافة إلى ذلك، قم بتضمين بئرين للتحكم يحتوي كل منهما على 100 µL من محلول PBS لكل ربيطة؛ وذلك لتحديد الامتصاصية الخلفية للمقايسة. غطِّ الطبق بغطاء وأحكم إغلاق الحواف بفيلم البارافين لتقليل التبخر. اترك الطبق طوال الليل في حضانة هزازة عند درجة حرارة 4 °C أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة محاليل القفيصة المعالجة من الطبق. بعد ذلك، أضف 200 microliters من محلول الحجب لكل بئر. تُحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، أو تُحفظ محكمة الإغلاق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius طوال الليل.

وفي هذه الأثناء، قم بتخفيف الأبتامر المبيوتن (biotinylated aptamer) ليصل تركيزه إلى 1 µM في ماء خالٍ من النوكلييز. وتأكد من وجود كمية كافية من المحلول بحيث تبلغ 200 µL إجمالاً لكل مجموعة علاجية.

كذلك، قم بتخفيف HPGA المبيوتني (biotinylated HPGA) المختار ليصل تركيزه إلى 30 microliters لكل milliliter في محلول الحجب (blocking buffer). وتأكد مجدداً من توفر كمية كافية من المحلول لتحقيق حجم إجمالي قدره 200 microliters لكل معاملة.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة محلول الحجب واغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام 200 µL من PBST لكل بئر. جفف الرطوبة المتبقية بتجفيف الطبق مقلوباً على مناشف ورقية معقمة. بعد ذلك، أضف 100 µL من محاليل ربط الربيطة لكل بئر، مع ضمان وجود بئرين لكل تركيبة من الربيطة والمعالجة الحرارية، ثم حضن الطبق المغطى على هزاز مداري بسرعة 60 RPM تقريباً لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الآبار كما هو موضح في البروتوكول النصي، أضف 100 µL لكل بئر من streptavidin horseradish peroxidase بتركيز 0.2 µg/mL في PBS.

تُحضن العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف باستخدام هزاز مداري قبل غسل الآبار مرة أخرى. بعد ذلك، وبعد عملية غسل أخرى، يُضاف 100 µL لكل بئر من ركيزة TMB وتُترك الصبغة لتتطور لمدة تتراوح بين 5 إلى 15 دقيقة. ثم تُراقب الآبار لملاحظة تغير اللون.

تأكد من تطوير اللون باستمرار لنفس الفترة الزمنية بين الأطباق المكررة، وكن على دراية بنطاق الامتصاص الخاص بقارئ الأطباق المستخدم. أوقف تطوير التفاعل بإضافة 100 µL لكل بئر من حمض الفوسفوريك بتركيز 1 M. اقرأ الطبق فوراً عند 450 nm.

قم بإنشاء إجراء تشغيل قياسي جديد للحجم في برنامج جهاز DLS كما هو موضح بالتفصيل في البروتوكول النصي. بعد ذلك، اختر سهم التشغيل الأخضر داخل البرنامج وقم بتسمية العينة.

خفف الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) المعالجة حرارياً بنسبة 1 إلى 10 في محلول 1X PBS للوصول إلى تركيز نهائي قدره 5 µg/mL. بعد ذلك، قم بترشيح العينة باستخدام مرشح بحجم مسام 1 micron لإزالة جزيئات الغبار؛ حيث إن تقنية DLS حساسة جداً للغبار، لأن الجسيمات الكبيرة تشتت الضوء بشكل أكبر بكثير من الجسيمات الصغيرة. انقل 50 µL من الـ VLPs المخففة إلى كوفيت (cuvette) مخصصة للأحجام الصغيرة وقابلة للتخلص. أدخل الكوفيت في حجرة العينات بالجهاز. ابدأ التشغيل واستخدم تبويبات "correlogram cumulant fit" و"expert advice" لتقييم جودة البيانات. أثناء التشغيل، تأكد من أن قيمة مؤشر تعدد التشتت (poly dispersity index) أقل من 0.3، مما يشير إلى قياس عالي الجودة.

في علامة تبويب Multiview، تأكد من أن معامل الارتباط ثابت وقريب من الواحد ولكن لا يتجاوزه في الوقت القصير، ثم ينخفض بشكل حاد إلى الصفر في وقت لاحق، وهو ما يميز حجم الجسيمات. استخدم علامة تبويب نصائح الخبراء للحصول على تعليقات حول جودة البيانات أثناء القياسات. بعد اكتمال القياس، تحقق مرة أخرى من أن قيمة مؤشر التشتت المتعدد (poly disperse index) أقل من 0.3.

تأكد من أن خط ملاءمة التراكمات يتبع نقاط البيانات بدقة في علامة تبويب ملاءمة التراكمات. أنشئ إجراء تشغيل قياسيًا جديدًا للحجم في برنامج جهاز DLS كما هو مفصل في البروتوكول النصي. حدد سهم التشغيل داخل البرنامج لفتح وتسمية عينة جديدة، واترك الجهاز حتى يصل إلى حالة التوازن الحراري.

انقل معلق الـ VLP إلى كيوفيت كوارتز صغيرة الحجم مع تجنب تكوين الفقاعات، وقم بالماصة ببطء على جدار الكيوفيت. بعد أن يصل الجهاز إلى حالة التوازن الحراري، أدخل الكيوفيت في حجرة العينات. وبعد الانتظار لمدة 10 ثوانٍ ليتوازن temperature العينة، ابدأ عملية القياس وشغّل الموقت في آن واحد.

أوقف المؤقت عند نهاية القياس الأول. اعتمد هذا الوقت كنقطة زمنية أولى. احصل على النقاط الزمنية اللاحقة من أوقات القياس التي سجلها البرنامج.

أجرِ المعالجة الحرارية كما في السابق، باستثناء استبدال PBS بمحلول HEPES بتركيز 10 millimolar وpH 7.4، وعدم تخفيف القسيمات (capsids) بعد المعالجة. بعد ذلك، انقل قطرة مقدارها 15 microliter من محلول القسيمات المعالج بالكامل باستخدام الماصة إلى غشاء البارافين. أمسك حافة الشبكة بالملقط مع السماح له بالإغلاق على الحافة لتثبيت الشبكة، ثم ضع الشبكة بحيث يكون الجانب الكربوني لأسفل فوق قطرة المحلول المعالج.

اترك الشبكة تتحضن لمدة 10 دقائق للسماح للقفيصة بالالتصاق بالشبكة. وبناءً على نقاء تحضير القفيصة، أضف غسلات من محلول HEPES على شكل قطرات بحجم 10 إلى 15 µL توضع في خط تالٍ لقطرة القفيصة المعالجة. بعد 10 دقائق، ارفع الشبكة مع القطرة.

ضع الشبكة بشكل عمودي تقريباً على قطعة من ورق الترشيح لامتصاص القطرة. بعد ذلك، استخدم الشبكة لالتقاط قطرة من محلول HEPES buffer بحجم 10 إلى 15 µL وتثبيتها لمدة 30 ثانية. وبعد انتهاء وقت الغسل البالغ 30 ثانية، قم بالامتصاص باستخدام قطعة أخرى من ورق الترشيح.

بعد ذلك، ضع قطرة بحجم 15 µL من محلول أسيتات اليورانيل بتركيز 2% على فيلم البارافين في منطقة فارغة. التقط قطرة أسيتات اليورانيل باستخدام الشبكة وثبتها لمدة 45 ثانية. ثم، قم بسحب أسيتات اليورانيل الزائد مع التأكد من إزالة معظم المحلول.

ضع الشبكة بحيث يكون الجانب الكربوني للأعلى على قطعة من ورق الترشيح، مع الحرص على ألا تلتصق الشبكة بالرطوبة الموجودة على الملاقط. بعد ذلك، ضع ورق الترشيح الذي يحمل الشبكة في طبق بتري زجاجي مفتوح. بعد تكرار هذه العملية لجميع المعاملات، ضع أنصاف أطباق بتري التي تحتوي على الشبكات في مجفف طوال الليل لتجف قبل فحصها باستخدام TEM.

يوضح الرسم البياني التالي انخفاض قدرة قفيصات فيروس النوروهوماني على الارتباط بمرور الوقت عند معالجتها في درجة حرارة 68 درجة مئوية. وكما هو ظاهر، فإن الارتباط بـ HPGA هو أول إشارة تختفي تماماً. عند هذه النقطة، يُفترض أن الغالبية العظمى من القفيصات في المحلول قد فقدت القدرة على الارتباط بـ HPGAs للخلايا المضيفة، وبالتالي لا يمكن إدخالها إلى داخل الخلية.

يعكس ارتباط الأبتامر (Aptamer) ارتباط HBGA، على الرغم من أن الأمر يتطلب معالجة حرارية أعلى قليلاً لإزالة الإشارة. يظهر هنا منحنى معامل ارتباط DLS ممثلاً للبيانات ذات الجودة الجيدة. وعند زمن يقترب من الصفر، يظل مخطط الارتباط (correlogram) ثابتاً عند قيمة قريبة من الواحد ولكن أقل منه.

ثم ينخفض بشكل حاد ليصل إلى الصفر عند زمن مميز لحجم الجسيمات. ومن المرجح أنه يمكن الوثوق بنتائج الحجم المستخلصة من هذه التجربة. وعلى العكس من ذلك، فإن منحنى معامل الارتباط هذا يمثل بيانات ذات جودة رديئة.

يبدأ مخطط الارتباط (correlogram) بقيمة أعلى من واحد ثم ينخفض تدريجياً حتى يصل إلى الصفر. لذا، لا ينبغي استخدام نتائج هذه التجربة. وهنا، تُظهر بيانات حجم الجسيمات ملف تجميع واضحاً للقشريات (capsids) التي عولجت عند 68 درجة Celsius، حيث تتشكل تجمعات فائقة بعد مرور حوالي 20 دقيقة.

يعتبر الوقت الذي يحدث عنده التجمع الفائق مميزاً لمدى حساسية الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) تجاه تلك المعالجة. يوضح هذا الشكل نتائج المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للمعالجة الحرارية للقفيصات الخاصة بنوروفيروس البشري. هنا، تمت معالجة القفيصات عند درجات حرارة تتراوح من 60 إلى 80 درجة Celsius من اليسار إلى اليمين.

كما يتضح، تتغير مورفولوجيا القفيصة بشكل جلي مع المعالجة، حيث تتجمع القفيصات وتتمسخ. ويُلاحظ ظاهرة مماثلة للقفيصات المعالجة عند 68 °C لمدة تتراوح من صفر إلى 25 دقيقة.

بمجرد إتقان هذه التقنيات، يمكن إنجازها في غضون فترة تتراوح من ساعة واحدة إلى 24 ساعة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد تطويرها، وفرت هذه التقنية مساراً إضافياً للباحثين في مجال فيروسات الأغذية لاستكشاف آليات وتأثيرات التعطيل على الغلاف البروتيني لفيروسات النورو البشرية. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (real-time RT-PCR) مع أو بدون معالجة مسبقة بإنزيم RNase، والترحيل الكهربائي لبروتينات الغلاف الفيروسي باستخدام SDS page، واختبارات اللويحات باستخدام فيروسات بديلة قابلة للزراعة، وذلك للحصول على رؤية شاملة وأكثر اكتمالاً لمدى انخفاض الحمل الفيروسي بعد علاج معين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الاستفادة من ارتباط اللجين، وتشتت الضوء الديناميكي، والمجهر الإلكتروني النافذ لاكتساب رؤى ميكانيكية إضافية حول تأثيرات علاج التعطيل على الغلاف البروتيني لفيروس النورو البشري.

لا تنسَ أن العمل مع بعض الكواشف المستخدمة قد يكون خطيراً، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية واتباع أفضل ممارسات السلامة المختبرية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.