أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

الهدف العام من هذه الطرق هو اكتساب مزيد من التبصر حول آثار العلاج على عدوى أو سلامة قفيصة نوروفيروس البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التعطيل الفيروسي غير المغلف. مثل ما يحدث لقدرة القفيصة الفيروسية على إصابة الخلية بعد علاج معين.

الميزة الرئيسية لهذه الأساليب هي أنها يمكن أن توفر نظرة ميكانيكية إضافية لعمل أي علاج معين على الفيروس. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لاستراتيجيات تعطيل نوروفيروس البشري ، إلا أن لديها أيضا إمكانية تطبيقها على الفيروسات الأخرى غير المغلفة مثل فيروس الأنف أو التهاب الكبد A.To البدء ، مخفف بروتين قفيصة نوروفيروس البشري المنقى ، يتم تجميعها في قفيصة إلى 50 ميكروغراما لكل مليلتر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X. استخدم حجما قصوى يبلغ 15 ميكرولترا في أنابيب PCR الفردية المغطية.

تأكد من أن الأنبوب يحتوي على ما لا يقل عن 600 نانوجرام من القفيصة وأن هناك 600 نانوجرام من القفيصة لكل تركيبة ترابط معالجة. بعد ذلك ، قم بتسخين جهاز التدوير الحراري إلى المعالجة الحرارية المطلوبة. بعد ذلك ، قم بتسخين جهاز تدوير حراري إضافي إلى أربع درجات مئوية للتبريد الفوري.

أضف الأنابيب بمحلول القفيصة إلى جهاز التدوير الحراري للوقت المطلوب. بعد التسخين ، انقل الأنابيب على الفور إلى جهاز التدوير المبرد مسبقا لمدة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتدوير الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لإيصال جميع القطرات إلى قاع الأنبوب.

تمييع محاليل القفيصة المعالجة و PBS إلى ثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر. تأكد من وجود ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من القفيصة المخففة المعالجة. بعد ذلك ، ضع 100 ميكرولتر من محلول القفيصة على كل بئر تأكد من وجود بئرين على الأقل لكل معالجة.

بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين بئرين للتحكم مع 100 ميكرولتر من PBS لكل رابط. هذا يوفر امتصاص الخلفية للمقايسة. قم بتغطية اللوحة بغطاء وأغلق الحواف بغشاء البارافين لتقليل التبخر.

اترك الطبق طوال الليل على حاضنة رج عند أربع درجات مئوية أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محاليل القفيصة المعالجة من اللوحة. ثم أضف 200 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للسد.

احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو يغلق عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في هذه الأثناء ، قم بتخفيف الأبتامير الحيوي إلى ميكرومولار واحد في ماء خال من النوكلياز. تأكد من وجود محلول كاف ل 200 ميكرولتر إجمالا لكل علاج.

أيضا ، قم بتخفيف HPGA البيوتينيل المختار إلى 30 ميكرولتر لكل مليلتر في المخزن المؤقت للحظر. مرة أخرى ، تأكد من وجود حل كاف للحجم الكلي 200 ميكرولتر لكل علاج. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب واغسل اللوحة ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر لكل بئر من PBST.

ربتي على الطبق رأسا على عقب على مناشف ورقية معقمة لتجفيف الرطوبة المتبقية. بعد ذلك ، عند 100 ميكرولتر لكل بئر من محاليل ربط الترابط التي تضمن وجود بئرين لكل مجموعة من روابط المعالجة الحرارية ، قم باحتضان اللوحة المغطاة على شاكر مداري عند حوالي 60 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الآبار ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من 0.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتافيدين والفجل الحار بيروكسيداز و PBS.

احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع رج برفق على شاكر مداري قبل غسل الآبار مرة أخرى. ثم ، بعد غسل آخر ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من ركيزة TMB واترك اللون يتطور لمدة خمس إلى 15 دقيقة. راقب الآبار للون.

تأكد من التطوير باستمرار في نفس الوقت بين اللوحات المكررة وكن على دراية بنطاق امتصاص قارئ اللوحة المستخدم. أوقف تطور التفاعل ب 100 ميكرولتر لكل بئر من حمض الفوسفوريك المولاري. اقرأ اللوحة على الفور عند 450 نانومتر.

قم بإنشاء إجراء تشغيل قياسي جديد الحجم في برنامج أداة DLS كما هو مفصل في بروتوكول النص. ثم حدد سهم التشغيل الأخضر داخل البرنامج وقم بتسمية العينة. قم بتخفيف الجسيمات الشبيهة بالفيروسات المعالجة حراريا أو VLPs من واحد إلى 10 في 1X PBS للتركيز النهائي البالغ خمسة ميكروغرام لكل مليلتر.

بعد ذلك ، قم بتصفية العينة بحجم مسام ميكرون واحد لإزالة جزيئات الغبار. DLS حساس للغاية للغبار ، حيث تنتشر الجسيمات الكبيرة في ضوء أكثر بكثير من الجسيمات الصغيرة. انقل 50 ميكرولترا من VLPs المخففة إلى كوفيت صغير الحجم يمكن التخلص منه.

أدخل الكوفيت في حجرة العينة الخاصة بالجهاز. ابدأ التشغيل واستخدم علامات التبويب الملاءمة التراكمية ونصائح الخبراء لتقييم جودة البيانات. أثناء التشغيل ، تحقق من أن تشتت poly لقيمة الفهرس أقل من 0.3 يمثل قياس الجودة.

في علامة التبويب multiview ، تأكد من أن معامل الارتباط ثابت وقريب من واحد في وقت قصير ولكن ليس أكثر منه وينخفض بشكل حاد عند الصفر في وقت لاحق ، وهو ما يميز حجم الجسيمات. استخدم علامة التبويب "نصيحة الخبراء" للحصول على تعليقات حول جودة البيانات أثناء القياسات. بعد اكتمال القياس ، تحقق مرة أخرى من تشتت بولي لقيمة المؤشر أقل من 0.3.

تأكد من أن خط الملاءمة التراكمي يتبع نقاط البيانات عن كثب في علامة التبويب ملاءمة المجمعات. قم بإنشاء إجراء تشغيل قياسي جديد للحجم في برنامج أداة DLS كما هو مفصل في بروتوكول النص. حدد سهم التشغيل داخل البرنامج لفتح عينة جديدة وتسميتها والسماح للأداة بالوصول إلى توازن درجة الحرارة.

انقل تعليق VLP إلى كوفيت كوارتز صغير الحجم وتجنب الفقاعات والماصة ببطء على جدار الكوفيت. بعد أن تصل الأداة إلى توازن درجة الحرارة ، أدخل الكوفيت في غرفة العينة. بعد الانتظار لمدة 10 ثوان حتى تتوازن درجة حرارة العينة ، ابدأ التشغيل وابدأ المؤقت في نفس الوقت.

أوقف المؤقت في نهاية القياس الأول. خذ هذا الوقت كنقطة زمنية أولى. الحصول على نقاط زمنية لاحقة من أوقات القياس المسجلة بواسطة البرنامج.

قم بإجراء المعالجة الحرارية كما كان من قبل باستثناء PBS البديل لأكوام 10 مللي مولار ، ودرجة الحموضة 7.4 ولا تقم بتخفيف القفيصة بعد العلاج. بعد ذلك ، قم بوضع الماصة الكاملة التي يبلغ وزنها 15 ميكرولترا من محلول القفيصة المعالج على غشاء البارافين. أمسك حافة الشبكة باستخدام ملاقط تسمح لها بالإغلاق على الحافة لتثبيت الشبكة ووضع جانب الكربون الشبكي لأسفل فوق قطرة المحلول المعالج.

دع الشبكة تحتضن لمدة 10 دقائق للسماح للقفيصة بالالتصاق بالشبكة. اعتمادا على نقاء مستحضر القفيصة ، أضف غسلات من محلول الكومة على شكل قطرات من 10 إلى 15 ميكرولتر موضوعة في خط بعد قطرة القفيصة المعالجة. بعد 10 دقائق ، التقط الشبكة بالقطرة.

ضع الشبكة بشكل عمودي تقريبا على قطعة من ورق الترشيح لإزالة القطرة. بعد ذلك ، استخدم الشبكة لالتقاط قطرة من 10 إلى 15 ميكرولتر من أكوام المخزن المؤقت واحتفظ بها لمدة 30 ثانية. بعد 30 ثانية من وقت الغسيل ، تخلص من قطعة أخرى من ورق الترشيح.

بعد ذلك ، ضع قطرة 15 ميكرولترا من محلول أسيتات اليورانيل بنسبة اثنين بالمائة على طبقة البارافين في منطقة فارغة. التقط قطرة أسيتات اليورانيل مع الشبكة واحتفظ بها لمدة 45 ثانية. بعد ذلك ، تخلص من أسيتات اليورانيل مع التأكد من إزالة معظم المحلول.

ضع جانب الكربون الشبكي لأعلى على قطعة من ورق الترشيح مع الحرص على عدم التصاق الشبكة بالرطوبة الموجودة على الملقط. ثم ضع ورق الترشيح مع الشبكة عليه في طبق بتري زجاجي مفتوح. بعد تكرار هذه العملية لجميع العلاجات ، ضع نصفين طبق بتري مع الشبكات في مجفف طوال الليل حتى يجف قبل المراقبة باستخدام TEM.

يعرض الرسم البياني التالي انخفاضا في قدرة الارتباط لقفيصة نوروفيروس البشرية بمرور الوقت عند معالجتها عند 68 درجة مئوية. كما يتضح ، فإن ربط HPGA هو أول إشارة تختفي تماما. في هذه المرحلة ، من المفترض أن الغالبية العظمى من القفيصة في المحلول قد فقدت القدرة على ربط HPGAs للخلية المضيفة وبالتالي لا يمكن استيعابها في الخلية.

يعكس ربط أبتامير ربط HBGA ، على الرغم من أن هناك حاجة إلى معالجة حرارية أكثر قليلا لإزالة الإشارة. يظهر هنا منحنى معامل ارتباط DLS الذي يمثل بيانات عالية الجودة. في الوقت القريب من الصفر ، يكون الارتباط ثابتا عند قيمة قريبة من واحد ، ولكن أقل من واحد.

ثم ينخفض بشكل حاد إلى الصفر في وقت مميز لحجم الجسيم. من المحتمل أن تكون نتائج الحجم من هذه التجربة قابلة للثقة. على العكس من ذلك ، يمثل منحنى معامل الارتباط هذا بيانات ذات جودة رديئة.

يبدأ الارتباط بقيمة أعلى من واحد وينخفض تدريجيا إلى الصفر. لا ينبغي استخدام نتائج هذه التجربة. هنا ، تظهر بيانات حجم الجسيمات ملف تعريف تجميع واضح للقفيصات المعالجة عند 68 درجة مئوية مع تشكل الركام الفائق بعد حوالي 20 دقيقة.

الوقت الذي يحدث فيه التجميع الفائق هو سمة من سمات قابلية VLPs لهذا العلاج. يصور هذا الشكل نتائج TEM للمعالجة الحرارية لقفيصة نوروفيروس البشرية. هنا ، تم علاج القفيصة عند 60 إلى 80 درجة مئوية من اليسار إلى اليمين.

كما يتضح ، يتغير مورفولوجيا القفيصة بوضوح مع العلاج حيث تتجمع القفيصة وتشويهها. لوحظت ظاهرة مماثلة بالنسبة للقفيصات التي تمت معالجتها عند 68 درجة مئوية لمدة صفر إلى 25 دقيقة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنيات في غضون ساعة إلى 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، وفرت هذه التقنية وسيلة إضافية للباحثين في مجال علم الفيروسات الغذائية لاستكشاف آليات وتأثيرات التعطيل على قفيصة نوروفيروسات البشرية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل RT-PCR في الوقت الفعلي مع وبدون معالجة RNase المسبقة ، وصفحة STS للقفيصة الفيروسية ، وفحوصات البلاك مع فيروسات بديلة قابلة للزراعة للحصول على رؤية شاملة أكثر اكتمالا للحد الفيروسي بعد علاج معين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام ربط الترابط ، وتشتت الضوء الديناميكي ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال لاكتساب مزيد من الأفكار الميكانيكية حول تأثيرات علاج التعطيل على قفيصة نوروفيروس البشرية.

لا تنس أن العمل مع بعض الكواشف المستخدمة يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية واتباع أفضل ممارسات السلامة في المختبرات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.