طريقة مريحة لاستخراج وتحليل مع اللوني السائل عالي الضغط الكاتيكولامينات العصبية وعلى نواتج الأيض

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ثلاثة ناقلات عصبية أحادية أمين واثنين من مستقلباتها في بول الرضيع في وقت واحد عن طريق استخراج مناسب في الطور الصلب مقترنا بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط مع الكشف الكهروكيميائي. يمكن لهذه الطريقة التنبؤ بالمركبات المستهدفة غير المستقرة وتحديدها في عينة كاملة مع سهولة التشغيل في وقت قصير. يمكن تنظيف الأمثلة الخاصة بك بسهولة من خلال نصاب ضيق مليء بالألياف ذو وجه صلب ، ويمكن إثراء التحليلات الموجودة في العينة بسهولة وإذابتها واكتشافها على نظام الكشف الكهروكيميائي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن استخراج وتحليل الناقلات العصبية الكاتيكولامين في السوائل البيولوجية أمر بالغ الأهمية في تقييم وظيفة المقاومة والأمراض ذات الصلة. سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب تجنب التعرض للضوء ، ويجب أن يكون وقت المعالجة المسبقة قصيرا قدر الإمكان. لتوضيح الإجراء ، لدينا Lanlan Wei و Qing Han ، وهما طالبان دكتوراه من مختبرنا.

للبدء ، قم بإعداد ملليغرامين لكل مليلتر من محلول DPBA عن طريق إذابة ملليغرامين من المركب في مليلتر واحد من الماء المقطر. قم بتخزين المحلول في الظلام عند أربع درجات مئوية. عند تحضير موسعات التحليل ، ضع في اعتبارك أن التركيب الكيميائي وخصائص الكاتيكولامينات غير مستقرة ، ولأنها تتحلل بسهولة ، يجب أن تكون موسعات عملية التحضير سريعة جدا ، ويجب تجنب التعرض لأشعة الشمس الرقيقة.

تزن 1.0 ملليغرام من النورادرينالين والإبينفرين والدوبامين و MHPG و DOPAC و DHBA القياسية الداخلية في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر. أضف 1.0 مل من الماء المقطر لإذابة كل مركبة ، باستثناء الأدرينالين ، الذي يجب إذابته في محلول حمض الهيدروكلوريك 0.01 مول لكل لتر. قم بتذبذب المعايير المحضرة في الظلام بسرعة عالية حتى تذوب التحليلات تماما.

هذه هي المخزونات الأولية ، ويمكن تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى عدة أسابيع. لتحضير مخزونات التحليل الثانوية من النورادرينالين والإبينفرين والدوبامين و DOPAC و MHPG ، قم بنقل خمسة ميكرولترات من كل مخزون من المواد التحليلية الأولية إلى 4،975 ميكرولتر من الماء المقطر في أنابيب طرد مركزي منفصلة سعة خمسة ملليلتر. قم بإعداد هذه المحاليل طازجة يوميا ، وقم بتخزين المحاليل في الظلام عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام.

بالنسبة إلى DHBA ، قم بنقل خمسة ميكرولترات من المخزون الأولي إلى 4،995 ميكرولتر من الماء المقطر في أنبوب طرد مركزي سعة خمسة ملليلتر ، وقم بتخزينه في الظلام بشكل منفصل عند أربع درجات مئوية. قم بإجراء مزيد من التخفيفات باستخدام مخزون التحليل الثانوي لإنشاء منحنى قياسي. قم بتخزين المحاليل في الظلام عند أربع درجات مئوية ، وقم بإعدادها طازجة يوميا.

بعد ذلك ، اختبر الجهد الأمثل لكاشف ECD ، باستخدام المخزون القياسي بالتركيز المناسب. قم بتغيير الجهد للعثور على قيمة حيث يكون للتحليلات أفضل مظهر للذروة. لتحضير 10 مل من المذيبات المميعة ، استخدم 5.5 مل من الماء المقطر ، ثم أضف 1.5 مل من الأسيتونيتريل وثلاثة ملليلتر من حمض الفوسفوريك ، قطرة قطرة ، في الماء.

لتحضير المرحلة المتنقلة ، قم بقياس المكونات المدرجة في بروتوكول النص في زجاجة نظيفة سعة لتر واحد. أضف 40 مل من الأسيتونيتريل والماء المقطر إلى 1 ، 000 مل. حرك واهتز بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة حتى تذوب المادة الموجودة في المحلول.

باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني مع قطب زجاجي ، اضبط قيمة الأس الهيدروجيني للمرحلة المتحركة على 4.21 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم المشبع. قم بتصفية المرحلة المتنقلة باستخدام غشاء دقيق يسهل اختراقه من البولي فينيلدين فلوريد 0.45 ميكرون وجهاز شفط فراغي لإزالة الشوائب. استخدم الاهتزاز بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة لتفريغ المرحلة المتنقلة في كل مرة قبل الاستخدام.

بعد ذلك ، قم بدوامة الطرد المركزي للعينات البولية عند 1 ، 510 مرة جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة معظم تداخل الجسيمات. اجمع المواد الطافية ، وتخلص من الرواسب لمزيد من التجارب. لاستخراج التحليلات بشكل فعال ، انتقل إلى استخراج الطور الصلب للألياف المعبأة ، أو المعالجة المسبقة PFSPE ، مباشرة بعد الطرد المركزي.

لتنشيط الألياف النانوية ، اضغط على 100 ميكرولتر من الميثانول و 100 ميكرولتر من الماء بالتتابع من خلال عمود PFSPE باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر بطريقة بطيئة. يجب خلط عينة البول بمحلول DPPA لتحسين كارهتها للماء ومساعدة الكاتيكولامينات والمستقلبات على امتصاص الألياف. يجب أيضا إضافة حل DHBA كمعيار داخلي.

امزج 100 ميكرولتر من عينة البول مع 100 ميكرولتر من ملليغرامين لكل مليلتر محلول DPBA و 30 ميكرولتر من 100 نانوغرام لكل مليلتر من محلول DHBA القياسي الداخلي في أنبوب Eppendorf سعة 0.5 مل. ثم اضغط على محلول العينة المختلطة من خلال عمود PFSPE باستخدام حقنة بلاستيكية من نوع الغاز سعة خمسة ملليلتر باستخدام قوة ضغط الهواء. قم بترشيح العمود ثلاث مرات باستخدام حقنة بلاستيكية من نوع الغاز سعة خمسة ملليلتر لتحميل 100 ميكرولتر من محلول DPBA في عمود SPE ، ودفع المحلول ببطء عبر الخرطوشة بضغط الهواء.

خطوة الشطف هذه ضرورية لأن محلول DPBA يمكنه إزالة الشوائب أثناء الاحتفاظ بالتحليلات ، وبالتالي تحسين الحساسية والانتقائية للتحليلات. بعد ذلك ، قم بتحميل 50 ميكرولترا من المادة المزيلة على عمود PFSPE ، وادفعها عبر العمود ، وجمع المصفاة بأنبوب Eppendorf سعة 0.5 مل. قم بتشغيل مزيل الغاز HPLC لتفريغ الهواء في النظام.

قبل تحليلات العينات، يجب أن يعمل النظام لأكثر من 0.5 ساعة مع المرحلة المتنقلة لموازنة وتقليل ضوضاء خط الأساس. عينة 20 ميكرولترا من الشطف باستخدام جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي ، ثم قم بحقنها في نظام HPLC ECD. عند اكتمال عمليات التشغيل، قم بإيقاف تشغيل خلية الكاشف باستخدام واجهة الكاشف.

لا تقم بإيقاف تشغيل الخلية باستخدام المفتاح الموجود في الجزء الخلفي من الكاشف ، فقد يؤدي ذلك إلى إتلاف الجهاز. قم بتغيير تركيبة المرحلة المتنقلة يدويا إلى 10٪ ميثانول و 90٪ ماء. بعد التشغيل لمدة 30 دقيقة على الأقل ، قم بتغيير المرحلة المتنقلة يدويا إلى الميثانول من فئة HPLC.

قم بتشغيل النظام لمدة 15 دقيقة لحمايته بالميثانول. قد يؤدي عدم تشغيل هذه الخطوة بعد وقت التشغيل الموصى به إلى تلف العمود والكاشف. قم بإيقاف تشغيل التدفق، ثم قم بإيقاف تشغيل مزيل الغاز.

انتقل إلى تحليل الكاتيكولامين كما هو موضح في بروتوكول النص. يظهر الكروماتوجرام لعينة الماء المسننة مع الأهداف والمعيار الداخلي بدون استخراج. في ظل حالة HPLC في البروتوكول ، تكون القمم المستهدفة الخمسة لطريقة PFSPE منفصلة جيدا وأعلى بكثير من تلك المستخرجة بواسطة خرطوشة حمض الفينيل بورونيك التجارية.

أيضا ، لم تظهر ذروة DOPAC في نتيجة استخراج خرطوشة PBA ، مما يشير إلى أن عمود PBA لم يكن قادرا على استخراج DOPAC. عندما تم استخراج عينة البول ، لم تتمكن طريقة PFSPE من استخراج الأهداف ذات التحديد الجيد للذروة فحسب ، بل يمكنها أيضا التخلص من معظم التداخل في البول. تم إنشاء منحنيات المعايرة لكل مركب عن طريق رسم نسبة مساحة الذروة ، مما يدل على خطية جيدة مع تركيز منخفض.

من أجل التحقق من صحتها بعينات بول حقيقية ، تم اختبار عينات البول ل 28 رضيعا شديدي الخطورة و 22 رضيعا أصحاء. في حين أن بعض الكاتيكولامينات لم تكن مختلفة بشكل كبير بين الفئات عالية الخطورة والصحة ، فإن الرضع المعرضين لمخاطر عالية لديهم كميات أعلى من مستقلب MHPG من المجموعة الشاهدة. لذلك ، قد يكون مستوى MHPG البولي علامة محتملة للتعرف المبكر على الرضع المعرضين لمخاطر عالية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في دقائق. أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير الرماد طازجا ، وتشغيل القلق بسرعة ، ومنع التعرض لأشعة الشمس المباشرة. تعد إضافة محلول حمض ثنائي فينيل بورات في خطوات الامتصاص والشطف أمرا بالغ الأهمية أيضا.

بعد هذا الإجراء, كما تدابير عدم إنهاء الكاتيكولامينات والمستقلبات في البلازما أو السائل النخاعي. يمكن إجراء الشظية من أجل تحديد عالمية هذا البروتوكول في اختبار السوائل البيولوجية الأخرى. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة العلاقة بين عجز النمو العصبي ومستوى الكاتيكولامينات البولية في عينات الأطفال.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء طريقة استخراج الطور الصلب باستخدام أشكال nair وجهاز بسيط ، يمكن أن تساعد شقوف الهواء PCE PS في نفايات الشركات DPBA في تنظيف الناقلات العصبية الكاتيكولامين في عينات البول. تمتد هذه التقنية نحو التشخيص المبكر للكاسيس المعرض لخطر تلف الدماغ عند الرضع. لأن التحليل المقارن كشف عن اختلافات غير طبيعية في MHPG الأحادي لأطفال التوحد ، مما يشير إلى أن مستقلبات الكاتيكولامين قد تكون علامة مرشحة مهمة.