تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم الكمي لتوطين الخلايا السلفية للقلب وتوزيعها أثناء تكوين أعضاء القلب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الإجابات الرئيسية في مجال نمو القلب من خلال السماح لنا بمراقبة توطين مجموعات سلف القلب أثناء التطور الجنيني الطبيعي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الصور الحجمية يمكن أن تنتج معلومات كمية حول ديناميكيات مستوى الأنسجة وأنه يمكن أتمتة خط أنابيب التحليل لتحسين قابلية التكرار.

على الرغم من أن هذه الطريقة توفر معلومات حول تكوين الأعضاء القلبية المبكرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الدراسة العامة للتطور الجنيني المبكر أو على تشكل الأعضاء الأخرى ذات الأهمية. في صباح اليوم الجنيني الثامن ، قم بتطهير بطن الفأر الحامل بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بعمل شق في البطن من خلال كل من الجلد وجدار الجسم. بدءا من قناة بيض واحدة ، قم بتشريح الدهون بعناية على طول جانب الرحم وصولا إلى عنق الرحم.

قم بعمل شق في عنق الرحم واستمر في الطرف العلوي من قطع قناة البيض الأخرى لتحرير الرحم بأكمله. اغسل الدم الزائد من الرحم في طبق طوله 10 سم يحتوي على PBS طازج وقطع الميزومتريوم بين كل ديسيدوم. انقل الأجنة إلى طبق طوله ستة سنتيمترات يحتوي على PBS طازج تحت مجهر تشريح واستخدم ملقط رفيع رقم خمسة لإزالة أنسجة الرحم من الأنسجة المتساقطة.

بعد ذلك ، قم بتقطيع طرف النصف الجنيني من الأجزاء العشرية بعناية للكشف عن الأجنة ، مع الضغط على العشريات لدفع الجنين الأول وسحبه بعناية. قم بتشريح أكبر قدر ممكن من الأنسجة الجنينية الإضافية دون الإضرار بمورفولوجيا واستخدم ماصة نقل لوضع الجنين في أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على PBS طازج على الجليد. عندما يتم حصاد جميع الأجنة ، استنشق PBS من كل أنبوب واشطف الأجنة باستخدام PBS الطازج.

بعد شفط PBS جيدا من كل أنبوب ، قم بتثبيت الأجنة في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بثلاث غسلات باستخدام PBS الطازج ، ثم قم بتخزين الأجنة عند أربع درجات مئوية. ابدأ باستبدال PBS بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للحجب لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، استبدل المخزن المؤقت المانع بخليط الأجسام المضادة الأولية المناسب والمخزن المؤقت المانع المخفف للحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية.

في صباح اليوم التالي ، استنشق الجسم المضاد الزائد واغسل الأجنة ثلاث مرات لمدة ساعة واحدة لكل غسلة في 0.1٪ Triton في PBS. بعد الغسيل الثالث ، أضف خليط الأجسام المضادة الثانوية المناسب إلى الأجنة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بثلاث غسلات كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بإلغاء تلطيخ الأجنة باستخدام DAPI في PBS لمدة 10 دقائق متبوعة بغسلتين لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتعليق الأجنة ببطء في وسط تركيب مضاد للبهتان مما يسمح للأجنة بالتوازن لمدة ساعة واحدة على الأقل مع نقر لطيف دوري لمساعدة العينات على السقوط في المحلول.

قبل تركيب الأجنة ، قم بعمل مجموعتين متوازيتين من خمس إلى ست طبقات من الشريط اللاصق المزدوج على بعد 15 إلى 20 ملم على شريحة مجهرية واحدة لكل جنين وضع قطرة 15 ميكرولترا من الوسط المضاد للبهتان على كل شريحة بين أكوام الأشرطة. انقل جنينا واحدا بعناية إلى كل قطرة واستخدم مجهر تشريح وملقط دقيق لوضع الأجنة بحيث تكون جوانبها الأمامية متجهة بعيدا عن الشريحة ومع محور أجسامها بما يتماشى مع المحور الطويل للشرائح. لوضع الغطاء ، ضع أولا جانبا واحدا من الزجاج على كومة واحدة من الشريط اللاصق المزدوج واستخدم الملقط لخفض الغطاء برفق حتى يلامس كومة الشريط الأخرى.

من المهم بشكل خاص وضع الأجنة وتركيبها بعناية. سيكون تصوير الأجنة التي لم يتم وضعها بشكل صحيح أكثر صعوبة وقد تتطلب معالجة إضافية للحصول على بيانات جيدة قابلة للقياس الكمي. استخدم ماصة لإضافة وسيط إضافي مضاد للبهتان بين الشريحة والغطاء لمنع العينة من الجفاف أثناء التصوير وتحديد أعلى هدف تكبير متاح يسمح بالتقاط منطقة الهلال القلبي بأكملها في مجال رؤية واحد.

ثم قم بإعداد معلمات التصوير باستخدام أفضل ممارسات التصوير القياسية واستخدم معدلات أخذ العينات Nyquist لتحديد أبعاد فوكسل XYZ لكل جنين. لتحليل صور الجنين ، قم بتحميل مجموعات بيانات الصور الأولية في برنامج تحليل الصور المناسب وافتح الملف الأول في عرض التجاوز. سيتم تحميل البيانات في عرض ثلاثي الأبعاد في وضع الإسقاط الأقصى للكثافة.

افتح نافذة ضبط الشاشة وحدد القناة المرجعية فقط. اضبط عتبة الصورة حسب الضرورة. إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة جدا للتجزئة ، فاضبط جاما.

يعد اتباع أفضل الممارسات أثناء الحصول على الصور أمرا بالغ الأهمية للحصول على البيانات المناسبة وسيعتمد على إعداد الفحص المجهري المحدد المستخدم. إذا كانت هناك حاجة إلى تعديلات على جاما ، فلا ينبغي استخدام هذه الصور لمقارنة شدة التألق. استخدم مربع حوار خوارزمية السطح لإنشاء سطح جديد للقناة المرجعية وحدد مربع أصل الاهتمام فقط للمقطع.

اضبط منطقة المربع المحيط بحيث تحتوي على منطقة الاهتمام كما هو موضح في الصبغة المرجعية وحدد القناة المرجعية من القائمة المنسدلة للقناة المصدر. اضبط التنعيم على نصف حجم Z voxel واستخدم منزلقات العتبة لضبط الحد الأدنى لشدته المطلقة لضمان عدم امتداد السطح إلى ما وراء إشارة القناة. قم بتصفية الكائنات حسب رقم فوكسل أو وحدة التخزين ، مع رفض أي كائنات خلفية قد تكون الخوارزمية قد أنشأتها وقم بإنهاء الخوارزمية.

بعد ذلك ، حدد السطح الذي تم إنشاؤه حديثا واختر وظيفة مجموعة القناع من نافذة التحرير. حدد القناة التجريبية ذات الاهتمام مع الحرص على تحديد خانة الاختيار القناة المكررة قبل تطبيق القناع وحدد قناة القناع فقط في نافذة ضبط العرض. ثم قم بإنشاء سطح جديد كما هو موضح للتو.

للحصول على البيانات الحجمية مع تحديد كل سطح، افتح علامة التبويب الفرعية التفاصيل في علامة التبويب الإحصائيات وحدد متوسط القيم من القائمة المنسدلة. سيتم العثور على الحجم الإجمالي للسطح في عمود المجموع في الجدول الذي تم إنشاؤه. هنا ، يظهر جنين فأر جنيني اليوم 8.25 مع خلايا سلف للقلب والأوعية الدموية البطينية إيجابية GFP مصنفة بجسم مضاد للهلال القلبي كما هو موضح للتو.

بعد تحديد القناة المرجعية للأنسجة الملطخة ، يتم ضبط الشدة وجاما قبل البدء في خوارزمية إنشاء الأسطح. يتم تحديد منطقة الاهتمام واختيار مستوى تفاصيل السطح. السطح الأولي عتبة ليشمل كل الإشارات الحقيقية في السطح.

ثم يتم إجراء التصفية لإزالة أجزاء الخلفية الصغيرة للحصول على سطح مرجعي نهائي. من خلال تحديد السطح المرجعي، يمكن تكرار قناة المقارنة وإخفائها. يتم ضبط الشدة وجاما لهذه القناة قبل إنشاء سطح ثان من خلال نفس تسلسل الخطوات.

ثم يتم حساب الحجم الإجمالي لكل سطح تلقائيا ويمكن مقارنته كميا وبصريا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة الأجنة التي تم تشريحها ، وكفاءة الجسم المضاد ، واتجاه التركيب ، وإعداد التصوير كلها تؤثر على جودة البيانات النهائية. بالإضافة إلى خط أنابيب التحليل الكمي هذا ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الالتفاف للحصول على بيانات نوعية إضافية.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التكنولوجيا الطريق للباحثين في تطوير القلب لاستكشاف ديناميكيات مجموعات السلف القلبية الجديدة خلال التطور الجنيني المبكر.