فحص الغزو باستخدام المصفوفات ثلاثية الأبعاد

طور العلماء نماذج ثلاثية الأبعاد لدراسة عمليات غزو الخلايا والهجرة بشكل أكثر دقة. في حين أن معظم أنظمة زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد ، فإن الخلايا الموجودة في أنسجتنا موجودة داخل شبكة ثلاثية الأبعاد من الجزيئات تعرف باسم المصفوفة خارج الخلية أو ECM. في حين أن العديد من العمليات الميكانيكية المطلوبة لحركة الخلية في 2D و 3D متشابهة ، فإن عوامل مثل انخفاض صلابة ECM مقارنة بالأسطح البلاستيكية ، وإضافة بعد ثالث للهجرة ، والعائق المادي للتحرك عبر شبكة البوليمرات الطويلة في ECM ، تمثل جميعها تحديات مختلفة للخلية مقارنة بالهجرة ثنائية الأبعاد.

سيقدم هذا الفيديو بإيجاز الوظيفة الأساسية وهيكل ECM ، بالإضافة إلى الآليات التي تعدل بها الخلايا وتهاجر من خلاله. بعد ذلك ، سنناقش بروتوكولا عاما يستخدم لدراسة غزو الخلايا البطانية. أخيرا ، سنسلط الضوء على العديد من تطبيقات المصفوفات ثلاثية الأبعاد لدراسة الأسئلة البيولوجية المختلفة.

لنبدأ بفحص تكوين ECM ، وكيف تتفاعل الخلايا معه.

يؤدي ECM العديد من الوظائف ، مثل توفير الدعم للخلايا ، وتسهيل الاتصال بين الخلايا ، وفصل الأنسجة. يختلف تكوين ECM بين الأنسجة المختلفة وله خصائص بيولوجية مختلفة ، ولكن يمكن تصنيفه إلى نوعين عريضين. يعمل الغشاء القاعدي على تثبيت الأنسجة وفصلها ، بينما تحيط المصفوفة الخلالية بالخلايا داخل الأنسجة وتدعمها. تتكون المصفوفة الخلالية في الغالب من بروتين الكولاجين الليفي ، ولكنها تشمل أيضا الإيلاستين والفيبرونكتين.

يجب أن تحدث العديد من العمليات البيولوجية حتى تهاجر الخلايا عبر ECM. الأول هو التصاق مصفوفة الخلية ، والذي يتضمن بروتينات عبر الغشاء تسمى الإنتجرين. تربط هذه ECM بالسقالة الداخلية للخلية ، والمعروفة باسم الهيكل الخلوي.

عملية أخرى هي إعادة الترتيب الهيكلي للهيكل الخلوي للخلية. هذا يؤدي إلى تكوين هياكل متخصصة تسمى invadopodia ، وهي نتوءات للخلية في المصفوفة المحيطة بها. الخطوة الأخيرة هي تعديل ECM. يتضمن هذا عادة جزيئات متدهورة تعرف باسم المصفوفة المعدنية أو MMPs ، والتي تتراكم في invadopodia وتتحلل ECM المحيطة ، مما يسهل غزو الخلايا. تسمح فحوصات غزو المصفوفة ثلاثية الأبعاد للعلماء بتصور ودراسة هذه العملية المعقدة.

الآن بعد أن أصبحت على دراية ب ECM وتفاعله مع الخلايا ، دعنا نتعرف على بروتوكول لدراسة غزو ECM بواسطة الخلايا البطانية لتكوين الأنابيب. من خلال زراعة الخلايا البطانية في بيئة ثلاثية الأبعاد ، يمكن للمرء محاكاة العملية البيولوجية لنمو الأوعية الدموية ، والمعروفة أيضا باسم تكوين الأوعية الدموية ، وهو أمر مهم أثناء التطور الطبيعي ، وكذلك السرطان.

أولا ، يتم زراعة الخلايا البطانية ، ويتم تحضير معلق خلية واحدة عن طريق معالجة الخلايا بالبروتياز مثل التربسين ، وتمريرها عبر مرشح شبكي لتفتيت كتل الخلايا. يتم بعد ذلك إذابة المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، التي تتكون عادة من الكولاجين أو الفيبرين أو اللامينين أو مجموعات أكثر تعقيدا من هذه المكونات - والتي يمكن تحضيرها في المختبر أو طلبها من البائعين التجاريين - على الجليد. نظرا لأن معظم مستحضرات ECM تتبلمر في درجات حرارة أعلى ، فمن المفيد الحفاظ على برودة المعدات والكواشف الأخرى أيضا. يتم خلط تعليق الخلية مع محلول المصفوفة المذاب لتضمين الخلايا ، ويتم وضع هذا الخليط في حاضنة زراعة الخلايا حيث تؤدي درجة الحرارة المرتفعة إلى بلمرة المصفوفة.

بمجرد ضبط المصفوفة المحتوية على الخلية ، تتم إضافة وسائط الثقافة التي تحتوي على عوامل الأوعية الدموية إلى طبق المصفوفة. باستخدام برنامج الفحص المجهري بفاصل زمني ، يمكن بعد ذلك تتبع الخلايا الفردية لمراقبة هجرتها عبر المصفوفة. يتم تحليل الصور الناتجة ، وتستخدم مواضع الخلايا لحساب اتجاه الحركة والمسافة بالميكرون. يمكن بعد ذلك رسم هذه القيم لتحديد النشاط الحركي - متوسط معدل هجرة الخلايا. أخيرا ، تتم ملاحظة تكوين شبكة الأنبوب وتحليله باستخدام برنامج التصور لتحديد ميزات مثل العقد والأنابيب والحلقات.

الآن ، دعنا نستكشف بعض تطبيقات المصفوفات ثلاثية الأبعاد في تجارب محددة.

يتم التوسط في هجرة الخلايا عن طريق التعديل النشط للهيكل الخلوي الخلوي. في هذه التجربة ، تم تحضير مصفوفات الكولاجين وخلطها مع بقعة تحتوي على بروتين فلوري أحمر للسماح بالتصور. تم عزل الخلايا الكروية الفردية ، وهي مجموعات خلايا عائمة بحرية ، ودمجها في مصفوفة الكولاجين. بعد الحضانة ، تم تلطيخ الخلايا المدمجة لمكونات هيكل خلوي محددة ، وتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري الفلوري. لاحظ الباحثون مكونات الهيكل الخلوي وتغييراتها عندما هاجرت الخلايا عبر ECM.

يمكن للعلماء أيضا دراسة كيفية تأثير خصائص ECM على الهجرة. باستخدام نظام هلام متحد المركز ، حيث يتم تضمين الخلايا في مصفوفة هلامية داخلية محاطة بمصفوفات خارجية بتركيزات متفاوتة ، يمكن للعلماء تتبع الخلايا باستخدام الفحص المجهري بفاصل زمني لدراسة هجرتها من الهلام الداخلي إلى الهلام الخارجي الخالي من الخلايا في البداية. لاحظ الباحثون أن الصلابة الأكبر للمواد الهلامية ذات التركيز العالي أدت إلى زيادات في كل من إزاحة الخلايا والمسافة الإجمالية لهجرة الخلايا.

أخيرا ، يمكن إجراء فحوصات غزو المصفوفة داخل حي لدراسة تكوين الأوعية في سياق خاص بالأعضاء. هنا ، تم إنشاء المواد الهلامية الفيبرينية - التي يشيع استخدامها في هندسة الأنسجة بسبب طبيعتها القابلة للتحلل - ، متبوعة بزرعها في رئتي الفأر حيث تم تثبيت المواد الهلامية في مكانها بواسطة "غراء" مصنوع من بروتين الفيبرينوجين. سمح لهجرة الخلايا وتكوين أوعية دموية جديدة بالحدوث لمدة 7 إلى 30 يوما التالية ، وبعد ذلك تم حصاد الرئتين والمواد الهلامية الفيبرينية وتثبيتها وتقطيعها. كشف تصوير هذه الأقسام عن تكوين الأوعية الدموية والحويصلات الهوائية في المواد الهلامية المزروعة ، مما أعطى الباحثين نظرة ثاقبة لهذا الجانب الحاسم من تطور الرئة في في الجسم الحي .

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول فحوصات غزو المصفوفة خارج الخلية. ناقش هذا الفيديو تكوين ECM وكيف تهاجر الخلايا من خلاله ، وقدم بروتوكولا بسيطا لدراسة هجرة الخلايا البطانية من خلال مصفوفة ثلاثية الأبعاد ، وسلط الضوء على العديد من العمليات الخلوية التي تتم دراستها حاليا في سياق تفاعلات الخلية وإدارة المحتوى المركزي للخلف. نظرا لأن هجرة الخلايا الذاتية تحدث في الفضاء ثلاثي الأبعاد ، فمن الأفضل محاكاة هذه الظروف البيولوجية بواسطة تقنيات الثقافة ثلاثية الأبعاد. ستستمر التحسينات في تكوين المصفوفة في السماح للعلماء بتكرار الهجرة الخلوية ودراستها بدقة أكبر في المختبر. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!