باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

العام من الفحص النقطي هو تقييم النمط الظاهري المهاجر لصفائح الخلايا المتماسكة المرفقة استجابة للإشارات البيئية الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان ، مثل كيفية تغيير السيتوكينات أو عوامل النمو لحركة الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لمقايسة النقاط هي أنه يمكن إجراؤها واستخدامها بسهولة للحصول على نتائج قابلة للتكرار.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لحركة الخلية ، إلا أنها تفسح المجال أيضا لمجموعة من المقايسات اللاحقة ، مثل تلطيخ الخلايا لتقييم مورفولوجيا مستعمرة النمو وتشتت الخلايا ، والتلوين المناعي ، وتحليل البروتين والحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، أو حقن الخلايا في. للبدء ، قم بإذابة كولاجين الفأر أربعة على الثلج ، وقم بتخفيفه ب 50 ميكرومولاكس HCL لتحضير ثلاثة ملليلتر من محلول الكولاجين الأربعة 10 ميكروغرام لكل مليلتر. أضف 250 ميكرولترا من محلول الكولاجين الرابع إلى آبار ألواح ذات قاع زجاجي مكون من 12 بئرا ، وضعها في صندوق بلاستيكي بحجم مناسب ومحكم الإغلاق.

ضع منشفة ورقية مبللة فوق الألواح وحولها لتصنيع غرفة رطبة ، وأغلق الصندوق. ثم احتضن الأطباق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي ، لتحريك الكولاجين غير الممتص والمخزن المؤقت ، استخدم الماء منزوع الأيونات لشطف الألواح مرتين ، وتوجيه الماء إلى حافة البئر ، بدلا من الحافة التي شكلها قاع الحافة وانزلاق الغطاء.

جفف الألواح بالهواء في غطاء تدفق رقائقي ، واستخدمها على الفور أو قم بتخزينها على أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى خمسة أيام. لتحضير معلق الخلية ، استخدم الخلايا التي نمت في طبق زراعة أنسجة 60 ملم في وسط DMEMF12 ، مع استكمال مصل الحصان بنسبة 5٪ إلى التقاء 80٪. استخدم DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لشطف الخلايا مرة واحدة ، ثم أضف 500 ميكرولتر من التربسين EDTA بدرجة حرارة الغرفة ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 في جو مرطب لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.

قم بتعليق الخلايا المنفصلة في 4.5 مل من وسط الثقافة لإيقاف نشاط التربسين ، واستخدم مقياس كثافة الدم لحساب 20 ميكرولتر من تعليق الخلية. اسحب الخلايا المتبقية في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر عن طريق الطرد المركزي عند 200 ضعف الجاذبية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في وسط الثقافة إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر.

لوضع الخلايا في وسط كل غطاء من الكولاجين المطلي بأربعة ألواح زجاجية ذات قاع زجاجي مكون من 12 بئرا ، ضع قطرة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية ، مع الحرص على عدم لمس الطلاء أو خدشه. لن ينتج عن طلاء قطرة غير دائرية ورقة خلية دائرية ، وإذا تم لمس الطلاء أو خدشه ، فسوف يمنع الخلايا من الالتصاق جيدا. احتضان الصفيحة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب لمدة 30 دقيقة ، للسماح للخلايا بالالتصاق.

ثم تحقق من وجود مرفق تحت المجهر المقلوب. باستخدام مليلتر واحد من وسط الاستزراع ، اغسل الآبار برفق مرتين ، لإزالة الخلايا غير المتصلة ، ثم أضف ملليلتر واحد من وسط الثقافة إلى كل بئر. تحقق تحت المجهر المقلوب من عدم وجود خلايا عائمة متبقية ، وإلا اغسل الآبار مرة أخرى.

احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 في جو مرطب للحصول على صفائح خلايا محددة جيدا. باستخدام مجهر مقلوب ، تحقق من جميع الآبار للتأكد من نمو مستعمرات الخلايا بشكل صحيح. إذا لزم الأمر ، ضع علامة على الآبار غير المناسبة ولا تستخدمها.

قم بتسمية كل بئر من اللوحة بشكل مناسب لكل حالة تم فحصها. قم بتشغيل كل شرط في نسخ مكررة أو ثلاثية. قم بتغيير الوسط لتجويع الخلايا في DMEMF12 تحتوي على 0.1٪ مصل الحصان ، قبل ثلاث ساعات من تحفيز الخلايا.

ثم قم بتحفيز الخلايا عن طريق إضافة EGF أو غيرها من الوسطاء المطلوبين. استخدم ماصة ميكرولتر واحد ، أو قم بتدوير اللوحة برفق لخلط الوسط. احتضن اللوحة لمدة يوم إلى أربعة أيام لمراقبة إزاحة الحواف ومحيط الحافة.

لإجراء تلطيخ H و E ، اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين وقم بإصلاحها لمدة دقيقتين تقريبا. أضف الهيماتوكسيلين لمدة دقيقتين تقريبا لتلطيخ النوى. اغسل الخلايا بماء الصنبور لمدة خمس إلى 10 دقائق ، حتى تصبح النوى زرقاء.

ثم قم بتلطيخ السيتوبلازم باليوزين لمدة دقيقتين قبل شطف الخلايا بالماء منزوع الأيونات. جفف اللوحة في الهواء ، ثم اقلبها واستخدم مسطرة لقياس قطر النقطة. بدلا من ذلك ، التقط صورا للوحة بكاميرا ، واستخدم ImageJ لتحليل قطر النقطة.

لإجراء الفحص المجهري بفاصل زمني ، قم بتشغيل مجهر الحاضنة ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. املأ جهاز الترطيب ب DH2O ، ثم اضبط ثاني أكسيد الكربون على 5٪ تأكد من ترطيب غرفة الحاضنة ، وأن المرحلة الآلية يمكن أن تتحرك بحرية. ثم أغلق غرفة الحاضنة واترك المجهر يتكيف مع 37 درجة مئوية.

ضع اللوحة على مسرح مجهر الحاضنة وقم بإعداد قائمة المسرح ، ثم قم بتصوير حافتين متعارضتين ومركز كل نقطة خلية. باستخدام هدف 10X ، التقط صورا كل ثلاث دقائق لمدة 15 إلى 24 ساعة. قم بتنزيل البيانات وتابع تحليل الصور في برنامج من اختيارك مثل Matlab.

في البداية ، كشف تصوير تباين الطور لنقاط الخلايا أن خلايا سرطان الثدي الغازية المكونة لمستعمرة الرئة تحافظ على نمط ظاهري لللحمة المتوسطة بعد التحفيز باستخدام EGF. ومع ذلك ، يتم ملاحظة الخلايا المفردة التي تغادر الورقة بشكل متكرر في نقاط الخلايا المحفزة ب EGF. تم تقييم استجابة خلايا سرطان الثدي المكونة لمستعمرة الرئة ل EGF بشكل أكبر عن طريق تلطيخ H و E للثقافات التي تم تحفيزها باستخدام EGF لمدة أربعة أيام.

في الواقع ، أدى تحفيز EGF إلى زيادة قطر المستعمرة ، مما يشير إلى أن هجرة الخلايا المحفزة ب EGF قد تتغير. في هذا الفحص النقطي ، تم تصوير الخلايا الموجودة على حواف الورقة لمدة تسع ساعات بعد تحفيز خلايا سرطان الثدي المكونة للمستعمرة باستخدام EGF. كشف PIV أن EGF زاد من سرعة الخلية إلى 0.63 ميكرومتر في الدقيقة من 0.45 ميكرومتر في الدقيقة في خلايا التحكم.

بالإضافة إلى ذلك ، قلل EGF من تباين اتجاه الخلية ، أو الانتشار الزاوي ، من 0.95 في الثقافات الضابطة إلى 0.79 في الثقافات المحفزة ب EGF. بالإضافة إلى ذلك ، كما لوحظ تلطيخ H و E بعد أربعة أيام ، زاد EGF من الإزاحة الشعاعية للحافة الظهارية على مدى تسع ساعات ، من 257 ميكرومتر إلى 356 ميكرومتر. بمجرد إتقانها ، يكون الوقت العملي لهذه التقنية بضع ساعات.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير بفاصل زمني ، والتلوين المناعي ، وتحليل الحمض النووي والحمض النووي الريبي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لتحليل ما إذا كان يتم التعبير عن البروتينات بشكل تفاضلي في الخلايا المهاجرة السريعة أو البطيئة ، أو عندما تهاجر الخلايا إلى البيئة المحيطة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مقايسة النقاط ، واستخدامه لتقييم النمط الظاهري المهاجر لصفائح الخلايا المتماسكة المرفقة استجابة لإشارات البيئة الدقيقة.