تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

الهدف العام من تقنية القرع النبيبي المنوي هذا هو تصور السمات الخلوية للحيوانات المنوية في الفئران والخلايا المنوية المنوية مع الحفاظ على سلامتها الخلوية. في هذا العرض ، نركز على تحليل الخلايا المنوية التي تخضع للانقسام الاختزالي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية للذكور ، مثل تمايز الخلايا الجذعية المنوية ، وفصل الكروموسوم الانتصافي ، والتمايز بعد الانتصافي للحيوانات المنوية المستديرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الحفاظ على السلامة الخلوية للخلايا الجرثومية الذكرية ، مما يسمح بفحص الهياكل الخلوية التي لا يمكن تصورها بسهولة باستخدام تقنيات أخرى. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحسين فهمنا للأسباب الأبوية للعقم في أي بلاتي. ويمكن تطبيقه على أنظمة الثدييات مثل الخصيتين المشتقة من الفئران أو المتبرعين بالأعضاء.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل صنع اسكواش جيد. يعد استخدام القوة الكافية وترتيب الأنابيب بشكل صحيح من العوامل المهمة لإنتاج طبقة أحادية متساوية من الخلايا. لكل فأر يتم تشريحه ، قم بتحميل طبقين من بتري مقاس 35 ملم ، أحدهما يحتوي على ثلاثة ملليلتر من PBS والآخر بملليلترين من محلول التحلل المثبت الطازج.

اختر الفئران التي تخضع للموجة الأولى من تكوين المنوية لمراقبة مجموعة سكانية غنية ذات أهمية. بعد التضحية بالفأر ، نظف البطن بالكحول بنسبة 70٪ ثم تابع الجراحة. اصنع فتحة على شكل حرف V في تجويف الحوض البطني وقم بإزالة الخصيتين عن طريق سحب وسادة الدهون البربخية باستخدام الملقط ، ولكن دون إزعاج الغلالة البربخية.

انقل الخصيتين إلى الطبق الذي يحتوي على PBS. هناك ، قم بإزالة غلالة الخصية عن طريق ثقب الأنسجة بالملقط الحاد وجمع الأنابيب المنوية السائبة. بعد ذلك ، انقل الأنابيب إلى الطبق بمحلول التحلل المثبت واترك التفاعل يستمر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أثناء الحضانة ، قم بإعداد شريحة زجاجية مطلية ب poly-L-lysine عن طريق تحديد حواف الشريحة بقلم مانع للسائل ثم ملء الشريحة ب 100 ميكرولتر من محلول التحلل المثبت داخل الحدود. بعد الحضانة لمدة خمس دقائق ، استخدم ملقطا ومقصا معقما لفصل الأنابيب المنوية بلطف وقطعها بحيث يتم الحصول على أجزاء فردية بحجم 20 ملم. بعد ذلك ، انقل خمسة أجزاء أنبوبية مقاس 20 ملم إلى الشريحة المعدة.

ثم استمر في تقسيم الأجزاء إلى أطوال تتراوح من 1.5 إلى ثلاثة ملليمترات باستخدام المقص. الآن باستخدام الملقط ، رتب الأجزاء بحيث لا تتداخل. وزعها بالتساوي عبر الشريحة.

من الناحية المثالية ، سيشغل 20 إلى 40 طولا قصيرا شريحة واحدة. ابدأ بإزالة السوائل الزائدة من تحضير الشريحة باستخدام منديل ماص. الآن ، ضع زلة غطاء وسحق الأنابيب باستخدام الضغط من كعب راحة اليد لمدة 10 إلى 20 ثانية.

الهدف هو تطبيق قوة كافية لتفريق الخلايا المنوية من الأنابيب المنوية. باستخدام مجهر التشريح ، تحقق من تعطيل الأجزاء بسبب القرع. بعد ذلك ، اسكب القليل من النيتروجين السائل في ديوار صغير وقم بتجميد الشريحة لمدة 15 ثانية أو حتى يتوقف السائل عن الغليانات.

للمضي قدما في نشاف الأمينات ، قم بإزالة زلة الغطاء على الفور باستخدام نقطة أو حافة حادة. على الرغم من أنها ليست مثالية ، إلا أنه يمكن الحفاظ على الشرائح المجمدة على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر وحفظها لمدة تصل إلى أسبوعين. لإزالة زلة الغطاء لاحقا ، اغمر الشرائح في النيتروجين السائل لمدة 15 ثانية وانزع زلة الغطاء.

لمتابعة وضع العلامات الأمينية ، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة باستخدام وعاء كوبلن سعة 50 مل. بعد الغسيل، ضع ملليلترا واحدا من محلول تخفيف الأجسام المضادة على كل شريحة لتكون بمثابة كتلة. اترك تفاعل الكتلة يعمل لمدة ساعة إلى ساعتين في غرفة رطبة.

لا تدع الشرائح تجف أبدا أثناء هذا الإجراء. بعد ذلك ، اضغط على الشرائح على منشفة ورقية لإزالة المخزن المؤقت برفق وإعادتها إلى الغرفة المرطبة. بعد ذلك ، ضع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف على كل شريحة وانقلها إلى 40 درجة مئوية حيث يمكن أن يستمر تفاعل الربط بين عشية وضحاها.

إذا كان محلول الأجسام المضادة مرتفعا ، فيمكن استخدام نصف الحجم إذا كان مغطى بقلة غطاء أو بارافيلم في اليوم التالي ، استخدم ثلاث غسلات في PBS لإزالة الجسم المضاد الأساسي. بعد ذلك ، ضع 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف واترك هذا التفاعل يستمر لمدة ساعة إلى ساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة.

لتجنب التبييض الضوئي ، احتفظ بالشرائح في غرفة رطبة مظلمة أثناء هذه الحضانة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام PBS. الآن ، قم بوضع نقاط على الشرائح باستخدام وسيط تثبيت يحتوي على DAPI.

ثم قم بإغلاق زلات الغطاء باستخدام طلاء الأظافر واستمر في التصوير. لالتقاط الصور ، استخدم مجهر التألق مع مرحلة آلية تتيح حركة المحور z الدقيقة. استخدم أيضا كاميرا عالية الدقة لالتقاط الصور.

الآن ، قم بتقييم الشرائح باستخدام هدف 20x. تحديد جودة تحضير الاسكواش. سيكون للقرع عالي الجودة طبقة أحادية من النوى موزعة بالتساوي.

قد تكون بعض مناطق القرع أفضل من غيرها. لاحظ إحداثيات أفضل المناطق للعثور عليها بسهولة تحت تكبير أعلى. الآن ، قم بزيادة التكبير إلى 100x.

ثم التقط صورا من المناطق الملحوظة التي تحتوي على طبقة أحادية متسقة من النوى. اضبط مكدسات z العلوية والسفلية لضمان التقاط كل الضوء في التركيز البؤري. يتم تحديد العدد الأمثل من مكدسات z بشكل عام بواسطة برنامج الحصول على الصور ويختلف لكل هدف.

من الصور ، قم بتجميع صورة ذات عمق ممتد باستخدام برنامج المعالجة. سيجمع البرنامج بين الضوء في التركيز البؤري من كل مكدس z ، وهو أمر ضروري للتصوير الأمثل لمستحضرات القرع الأنبوبية. باستخدام طريقة القرع الأنبوبي الموصوفة ، تم تصور مجموعات الخلايا العابرة التي تخضع للطور الأولي إلى انتقال الطور الأول.

تم تصور مجموعات مخصبة من الخلايا المنوية الطورية الأولى باستخدام الأجسام المضادة ضد ألفا توبولين. لتصور الخلايا في الطور الأول ، تم تصنيف مستحضرات القرع الأنبوبي بجسم مضاد للبروتين المركب المشبكي 3. تم تحديد كل من الخلايا المنوية المرحلية من اللبتوتين والزيجوتين والباشيتين.

تم استخدام الأجسام المضادة ضد دورة الخلية كيناز أورورا ب لتصور الأحداث اللاحقة للانقسام الاختزالي الأول. يحدد هذا الكيناز في السنترومير الداخلي أثناء الطور ، ثم يعاد توطينه إلى المنطقة الوسطى للمغزل أثناء الطور ، وأخيرا إلى ثلم الانقسام أثناء الحركية الخلوية. من خلال الحفاظ على السلامة الخلوية ، تسمح تقنية الاسكواش الأنبوبي بتصور التنظيم تحت الخلوي في الهياكل المرتبطة بالطور الأول.

يمكن اتباع ديناميكيات باقة الكروموسوم من خلال الطور الأول. يمكن أيضا تصور ازدواجية المنشأ في انفصال الجسيم المركزي. في مرحلة ديبلوتين المبكرة ، تم تصور الخلايا المنوية التي تخضع لانفصال الجسيم المركزي بعد ازدواجية المنتز مع الأجسام المضادة ضد المحيط بسنترين ، وهو مكون بروتيني في المصفوفة المحيطة بالمركز والأجسام المضادة ضد Centrin-3 لتمييز المريكزات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التقييم السريع للسمات الخلوية لتطور الخلايا المنوية في الفئران مع الحفاظ على السلامة الخلوية. بمجرد إتقانها ، يمكن تحقيق التشريح من خلال السحق في أقل من ساعة واحدة لكل ماوس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام قوة كافية لتفريق الخلايا المنوية من الأنابيب

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين التركيز المثبت ووقت الحضانة اعتمادا على البنية الخلوية المراد دراستها. يمكن تنفيذ استراتيجيات التصور البديلة ، مثل مناهج أسماك الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، بسهولة باستخدام هذه التقنية. من خلال استكمال القرع الأنبيبي بالمقايسات الكيميائية الحيوية النهائية ، من الممكن تقييم المحددات الميكانيكية للتقدم الانتصافي الناجح.