نهج بسيط للحث على العصب الذاتية التجريبية في الفئران C57BL/6 للتقييمات الفنية ولاثيل
نوفمبر 9, 2017
يوجز هذا التقرير نهج بسيط للحث على نجاح العصب الذاتية التجريبية (EAN) استخدام البروتين المايلين صفر الببتيد180-199 (P0) في تركيبة مع adjuvant فروند بالكامل والسمية السعال الديكي. نحن نقدم نموذجا متطورة قادرة على دقة تقدير مدى عجز وظيفي وأمراض الأعصاب التي تحدث في هذا EAN.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي أو EAN بنجاح في نموذج فأر للتحليل الوظيفي والمرضي لعملية المرض. يمكن استخدام نموذج EAN لمعالجة الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالاعتلال العصبي المحيطي. إنه أيضا نموذج رائع للتحقيق في فعالية العوامل العلاجية الجديدة.
الميزة الرئيسية لهذا النهج هي أنه يوفر نموذج اختبار وظيفي بسيط وموضوعي يمكن تطبيقه عند استخدام نموذج EAN في الماوس. يوضح الإجراء معي اليوم سانغ وون يو ، وهو طالب جامعي في مختبر بيولوجيا التغذية العصبية والمايلين في جامعة ملبورن. قبل ثلاثة أيام من تحريض المرض ، قم بتشغيل جهاز تقييم الوظيفة الحركية وقم بتشغيل زر الضوء.
التقط الماوس وقم بخفضه في وعاء من صبغة الطعام الحمراء. ضع الماوس في حجرة المشي واضبط سرعة جهاز المشي على 15 سم في الثانية. قم بتشغيل جهاز المشي وانقر فوق "تسجيل" لاستخدام نظام تصوير وظيفة المشي لالتقاط حركة تشغيل الماوس لمدة 36 ثانية.
بعد 36 ثانية ، أوقف التسجيل وجهاز المشي واحفظ ملف فيديو تشغيل الممارسة لتشغيل الممارسة في المجلد المخصص. قبل يوم واحد من التحصين الأول ، استخدم حقنة 0.5 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 30-1 / 2 لإدارة 1.6 ميكروغرام لكل ملليلتر من سم السعال الديكي في 250 ميكرولتر من PBS IP متساوي التوتر للفأر لتخدير الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع. بعد ذلك ، قم بتسجيل الفئران بحثا عن العلامات السريرية ل EAN على مقياس من صفر إلى أربعة وفقا للجدول وقم بإجراء تقييم الوظيفة الحركية كما هو موضح للتو.
في اليوم التالي ، امزج كميات متساوية من محاليل الببتيد المحضرة حديثا في محلول ملحي 0.9٪ و 20 ملليغرام لكل ملليلتر من المتفطرة السلية في مساعد فرويند الكامل في حبة حبة واخلط المحاليل بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل حقنة مزودة بإبرة قياس 23 باللقاح وقم بقلب المحقنة ورجها قبل إخلاء أي هواء داخل عمود المحقنة. قبل إعطاء اللقاح ، قم بإزالة الشعر بشكل جانبي إلى خط الوسط بين لوح الكتف وقم بتطهير الجلد المكشوف بنسبة 70٪ من الإيثانول.
بعد ذلك ، استخدم زوجا من ملقط Adson للإمساك بالجلد وتوصيل 50 ميكرولترا من المحلول إلى الفأر المحقون بسم السعال الديكي عن طريق الحقن تحت الجلد. في صباح اليوم التالي ، قم بتسليم 1.2 ميكروغرام لكل ملليلتر من سم السعال الديكي في 250 ميكرولتر من PBS IP كما هو موضح للتو متبوعا ب 1.2 ميكروغرام آخر لكل حقنة لكل مليلتر من سموم السعال الديكي IP بعد 48 ساعة. بعد ثلاثة أيام من الحقن الثالث للسعال الديكي ، قم بإعطاء 50 ميكرولترا أخرى من اللقاح المحضر حديثا في نفس موقع الحقن كما كان من قبل وراقب النتيجة السريرية والوظيفة الحركية للحيوانات مرتين في الأسبوع حتى نهاية التجربة.
يؤدي P0 180-199 EAN الناجم عن الببتيد في الفئران C57BL / 6 إلى مرض أحادي الطور مع بداية النتيجة السريرية من ستة أيام بعد التحصين الأول وشدة الدرجة القصوى في 25 يوما بعد التحصين الأول ، يليه بعض التحسن في النتيجة السريرية بعد 40 يوما من التحصين الأول. تبدأ الفئران في الفشل في مهمة تشغيل بسيطة في وقت مبكر يصل إلى ستة أيام بعد التحصين الأول مع قدرة ضئيلة على إكمال مهمة تشغيل بسيطة على جهاز المشي بحلول 35 يوما بعد التحصين الذي لا يتحسن في القدرة على الجري بعد 55 يوما من التحصين الأول. يكشف فحص الأجزاء شبه الرقيقة من الأعصاب الوركي لفئران EAN التي يسببها الببتيد عن مناطق إزالة الميالين مقارنة بالأعصاب الوركي من الضوابط الصحية المطابقة للعمر.
تسمح صور المجهر الإلكتروني عالي الطاقة بتحديد سمات مرضية عصبية محددة مثل إزالة الميالين ، وتلف صفيحة المايلين ، وعلامات إجهاد المحور العصبي مثل تورم الميتوكوندريا. تظهر هذه أيضا أضرارا محورية حادة كما يتضح من تعبير بروتين سلائف بيتا أميلويد المرتفع بشكل مؤلم في الأعصاب الوركي الذي لم يتم ملاحظته في أنسجة التحكم الصحية المطابقة للعمر. كما لوحظ اتساع العقد وتعطيل جنون العظمة.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الحقن تحت الجلد في غضون حوالي خمس إلى 10 دقائق لكل فأر مع الحد الأدنى من فرصة حدوث أي خطأ في الحقن. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم حقا أن تراقب موقع الحقن للتأكد من بقاء كل اللقاح داخل موقع الحقن وأنه لا يتسرب أي منها. يعد التقاط الفيديو لمشية جهاز المشي أمرا رائعا لأنه يتيح حساب المعلمات الأخرى مثل مرحلة التأرجح أو طول الخطوة وقد تصبح هذه المقاييس مهمة عند اختبار فعالية العلاجات الجديدة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حقا لكيفية تحفيز EAN في ذكور الفئران C57BL / 6. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون لديك فهم جيد حقا لكيفية وضع الحقن تحت الجلد بأمان ودقة حقيقية لضمان عدم وجود خطأ في الحقن. لا تنس أن العمل مع الإبر واللقاح ، هناك فرصة للإصابة خاصة عند استخدام الأدوات الحادة.
لذلك ، لتجنب أي فرصة للإصابة ، من الجيد حقا استخدام الملقط دائما وعدم الإمساك بالجلد أو الأنسجة يدويا وأيضا استخدام المحاقن ذات الاستخدام الواحد ، وعدم التغطيتها في هذه العملية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منهجية لاستحثاث التهاب الأعصاب المناعي التجريبي (EAN) في نموذج فأر باستخدام ببتيد بروتين الميالين صفر (P0) 180-199 إلى جانب مساعد فروند الكامل وسم داء السعال الديكي. والهدف من ذلك هو تسهيل التحليل الوظيفي والباثولوجي لاعتلال الأعصاب الطرفية، مما يوفر رؤى حول عملية المرض والعلاجات المحتملة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الاضطرابات المناعية الذاتية
- الاعتلال العصبي المحيطي
خلفية علمية
- يعد التهاب الأعصاب المناعي الذاتي التجريبي (EAN) نموذجاً لدراسة الاعتلال العصبي المحيطي.
- يعتبر هذا النموذج عملياً لتقييم العوامل العلاجية الجديدة.
- تساعد الاختبارات الوظيفية أثناء الدراسة في إجراء تقييم موضوعي.
- تشمل تقييمات السلوك الرئيسية الوظيفة الحركية والتسجيل السريري.
الغرض من الدراسة
- لتحفيز التهاب الأعصاب التجريبي (EAN) بكفاءة في فئران C57BL/6 لأغراض البحث.
- لتحليل مدى العجز الوظيفي والاعتلال العصبي المرضي.
- لإنشاء بروتوكول قابل للتكرار للدراسات المستقبلية حول اعتلال الأعصاب الطرفية.
الطرق المستخدمة
- تتضمن المنصة استخدام جهاز سير كهربائي ونظام تصوير لوظائف المشي لإجراء التقييمات الوظيفية.
- يركز النموذج على ذكور الفئران من سلالة C57BL/6 لعملية تحريض التهاب الأعصاب التجريبي (EAN).
- لم تذكر الدراسة أي سير عمل للتحليلات متعددة الأوميكس (multiomics).
- يتضمن البروتوكول حقنات تحت الجلد متنوعة في فترات زمنية محددة بعد التحصين.
- تُجرى تقييمات الوظيفة الحركية عدة مرات خلال الدراسة لمراقبة تطور المرض.
النتائج الرئيسية
- تؤكد الدراسة أن مسار المرض أحادي الطور، حيث تبلغ الأعراض السريرية ذروتها بعد 25 يوماً من التحصين.
- لوحظ تراجع وظيفي ملحوظ في أداء المهام الحركية من اليوم السادس وحتى اليوم 35.
- يُظهر التحليل الباثولوجي العصبي وجود فقد للنخاعين وتلف محوري في الفئران المعالجة مقارنة بمجموعة الضبط.
- يشير ارتفاع تعبير البروتين السليفة لبيتا أميلويد إلى حدوث إصابة محورية حادة.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً واضحاً وفعالاً لتحفيز EAN، مما يسهل فهم الاعتلال العصبي المرضي.
- تدعم الرؤى المكتسبة حول مسار المرض الأبحاث المستقبلية المتعلقة بالعلاجات المحتملة للاعتلال العصبي المحيطي.
- تعزز هذه النتائج استيعاب الآليات المناعية الذاتية التي تؤثر على الجهاز العصبي المحيطي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول تحفيز التهاب الأعصاب المناعي التجريبي في فئران C57BL/6، وهي سلالة تتوفر لها أدوات جينية واسعة، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية للمرشحات العلاجية التي تستهدف زوال الميالين الطرفي. يوفر هذا النموذج قراءات وظيفية ومرضية عصبية كمية تعزز الثقة التنبؤية في التقييم قبل السريري لاستراتيجيات إصلاح الميالين والحماية العصبية. إن قابليته للتكرار وتوافقه مع النهج المعدلة وراثياً يجعل منه أداة ترجمية للتحقق من الأهداف في أبحاث الاعتلال العصبي الطرفي المناعي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الآليات الممرضة في الاعتلال العصبي المحيطي المناعي الذاتي من خلال تنشيط مناعي محفز بواسطة الببتيد في مضيف يمكن التعامل معه وراثياً.
- القيمة التشغيلية: تعتمد على خلفية C57BL/6، مما يسمح بالتكامل مع نماذج التعطيل الجيني (knockout)، والإدخال الجيني (knock-in)، ونماذج المراسل (reporter models) لتقليل المخاطر المتعلقة بالأهداف المسببة.
- القيمة التنبؤية: تدعم اختبار الفرضيات حول مسارات تلف الأعصاب بوساطة مناعية، مما يساعد في اتخاذ قرارات مبكرة بشأن المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) فيما يخص المرشحات العلاجية المعدلة للمناعة أو المحفزة لإعادة تكوين الميالين.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يولد تدهوراً وظيفياً قابلاً للقياس الكمي عبر تحليل المشية على جهاز المشي، مما يتيح المراقبة الطولية للعجوزات الحركية كعلامة بيولوجية للديناميكا الدوائية.
- القيمة التشغيلية: يدعم التسجيل السريري الموحد (مقياس 0–4) والتحصينات الموقوتة استحثاثاً قابلاً للتكرار للمرض عبر مجموعات الدراسة.
- جاهزية المقايسة: متوافقة مع التقييم neuropathological الأعمى، بما في ذلك التقطيع إلى أقسام شبه رقيقة والمجهر الإلكتروني، للتحقق من ارتباط المركبات الواقية للأعصاب بالهدف.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحاكي السمات المرضية العصبية الرئيسية لإزالة الميالين الطرفي لدى البشر، بما في ذلك التلف المحوري الذي يثبته ارتفاع البروتين السلائفي لبيتا-أميلويد، مما يدعم الصلة الآلية.
- الاستمرارية الانتقالية: يتيح تقييم المرشحات العلاجية عبر مراحل المرض، من بداية الظهور (اليوم 6) إلى الذروة (اليوم 25) والتعافي (اليوم 40)، مما يفيد في تحسين الجرعة والتوقيت.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: يسهل تقييم كفاءة إصلاح الميالين والحماية العصبية، مما يقلل من عدم اليقين البيولوجي قبل الدراسات التمكينية لتقديم طلب دواء جديد (IND).
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف التي تبدأ من التحقق من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى اختبار الفعالية في المرحلة ما قبل السريرية، لا سيما بالنسبة للمواد البيولوجية أو الجزيئات الصغيرة التي تهدف إلى تعديل الاستجابات المناعية الذاتية أو تعزيز سلامة المحاور العصبية في الاعتلال العصبي المحيطي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم تقليل مخاطر الآليات من خلال تمكين الحث المتحكم فيه للمناعة الذاتية الخاصة بالجهاز العصبي المحيطي (PNS) للتحقق من الأهداف المشاركة في التفاعلات بين الجهاز المناعي والأعصاب.
- المسح: توفر منصة معيارية لتقييم تأثيرات المركبات على الوظيفة الحركية والاعتلال العصبي المرضي، مع مخرجات قابلة للتصوير عالي المحتوى والتقييم.
- التحليلات: تولد بيانات وظيفية طولية (معاملات المشية، طول الخطوة، مرحلة التأرجح) ومقاييس نسيجية مرضية نهائية للتحليل المقارن عبر مجموعات العلاج.
- الأبحاث الانتقالية: تتوافق مع التحقق قبل السريري من خلال نمذجة السمات المزمنة-المنتكسة والاعتلال المحوري المرتبط بالاعتلالات العصبية المحيطية البشرية.
- إعادة الاستخدام في المؤسسة: تؤسس منصة مناعية-عصبية قابلة لإعادة الاستخدام للاختبار التكراري للفرضيات العلاجية عبر مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي في نماذج الاعتلال العصبي المحيطي من خلال تمكين استحثاث دقيق وقابل للتكرار لإزالة الميالين بوساطة مناعية والإجهاد المحوري.
- القيمة التشغيلية: إن وجود جدول زمني محدد للتمنيع والتعزيز، مقترناً باختبارات وظيفية موحدة، يعزز إمكانية التكرار بين المختبرات ويقلل من التباين.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن الثقة في اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير أدلة مبكرة وقابلة للقياس على تعديل الهدف في نظام ذي صلة بالمرض.
- التأثير على محفظة المشاريع: يدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحات التي تظهر تأثيرات على كل من النتائج الوظيفية والنهايات المرضية العصبية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التعامل مع الفئران، وتقنيات الحقن تحت الجلد، والتثبيت بالتروية للتحليل المرضي العصبي.
- تعتمد على إمكانية الوصول إلى أنظمة تصوير المشية على جهاز المشي ومعدات التقطيع لشرائح شبه الرقيقة والمجهر الإلكتروني.
- تستلزم تدريباً معيارياً للتسجيل السريري والتقييم الأعمى لضمان اتساق البيانات بين المشغلين.
- تتطلب تعديل تركيز الببتيد وتركيبة المادة المساعدة عند التعميم على سلالات فئران أخرى نظراً لتفاوت الاستجابة المناعية.
- تقتصر على مسار المرض أحادي الطور؛ وقد لا تماثل الأشكال الانتكاسية الخاملة أو المزمنة المترقية من الاعتلال العصبي الطرفي دون تعديل البروتوكول.
