What is biotin and why is it used in cell-surface labeling experiments?

Biotin, also known as vitamin H, is a small, water-soluble molecule ideal for labeling cell surface proteins. The sulfo-NHS-SS-biotin derivative used in these assays contains a sulfo group that imparts strong charge, making it membrane impermeant so it labels only surface proteins. This allows scientists to track protein internalization without the label entering the cell prematurely.

How does temperature control regulate the biotinylation assay protocol?

The assay uses temperature shifts to control endocytosis timing. Cells are maintained at 4°C, a restrictive temperature preventing endocytosis, during initial biotin labeling. They are then moved to 37°C, a permissive temperature allowing endocytosis of labeled proteins. Finally, cells return to 4°C to halt endocytosis, ensuring precise measurement of internalized proteins during the defined window.

What role does L-glutathione play in distinguishing internalized from surface proteins?

L-glutathione is a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent that cleaves disulfide bonds on the biotin label. It removes biotin from unendocytosed surface proteins but cannot penetrate the cell membrane to reach internalized proteins. This selective cleavage leaves only biotinylated proteins that were protected inside the cell, enabling quantification of internalized proteins.

How are biotinylated proteins isolated and identified in the cell-surface biotinylation assay?

After cell lysis, biotinylated proteins are isolated using streptavidin-coated beads, which bind biotin with extremely high affinity. Following washing steps to remove contaminants, proteins are eluted using detergents and reducing agents. The recovered proteins are then separated by gel electrophoresis and analyzed using Western blotting with protein-specific antibodies for visualization and quantification.

What can scientists learn by measuring dopamine transporter endocytosis using biotinylation?

By applying the cell-surface biotinylation assay to dopamine transporter (DAT), scientists can quantify the percentage of DAT proteins internalized from the cell membrane. This measurement reveals how cells regulate neurotransmitter transporter availability and can show how drugs like protein kinase C activators affect transporter internalization, providing insights into cellular signaling and drug responses.

How can the biotinylation assay be modified to measure protein recycling?

To measure recycling, researchers perform the standard biotinylation protocol, then add steps after cleaving biotin from unendocytosed surface proteins. They raise temperature back to 37°C to allow internalized, biotin-tagged proteins to recycle back to the membrane. By comparing internalized protein amounts before and after recycling, scientists quantify the percentage of proteins recycled, as demonstrated with CFTR channel protein studies.

Why is the cell-surface biotinylation assay important for studying endocytosis and exocytosis pathways?

The biotinylation assay directly measures how cells regulate surface protein density through an introduction to endocytosis and exocytosis mechanisms. By tracking labeled proteins through internalization, degradation, and recycling pathways, scientists can quantify the spatiotemporal distribution of membrane proteins and understand how cells respond to extracellular signals and regulate cellular transport processes.

مقايسة البيوتينيل على سطح الخلية

0 مشاهدة09:13 دقيقة

يمثل وضع العلامات على بروتينات سطح الخلية بالبيوتين أداة قوية لدراسة مسارات النقل الخلوي المشاركة في تنظيم بروتينات الغشاء. تحتفظ الخلية بمجموعة منظمة بإحكام من البروتينات على السطح ، بحيث يمكنها تلقي المعلومات خارج الخلية والاستجابة لها عبر العديد من مسارات الإشارات. يقترح أن يشارك الالتقام الخلوي ، وهو عملية ابتلاع ، في تنظيم هذه البروتينات السطحية للخلية عن طريق التسبب في استيعابها. لذلك ، فإن وضع العلامات على هذه البروتينات قبل أن يتم خلطها بعوامل مثل البيوتين يساعد العلماء على تحديد استيعابها ودراسة أدوارها في المسارات الخلوية.

في هذا الفيديو ، سنناقش مبادئ ومنهجية فحوصات البيوتينيل على سطح الخلية ، ونستكشف بعض الطرق التي يتكيف بها العلماء مع هذه الطريقة اليوم.

دعنا أولا نراجع المبادئ الكامنة وراء مقايسة البيوتينيل لسطح الخلية.

كما ذكرنا سابقا ، تستخدم الخلايا مسارات داخلية لتنظيم الكثافة الزمانية المكانية وتوزيع البروتينات السطحية. يتم نقل البروتينات الداخلية من خلال مسارات خلوية محددة ، وبعد ذلك يمكن تحويلها إلى الليزوزوم للتحلل ، أو إعادة تدويرها مرة أخرى إلى سطح الخلية لاستمرار النشاط. تم تصميم البيوتينيل على سطح الخلية لقياس هذه العمليات.

العلامة المستخدمة في هذا الاختبار ، البيوتين - المعروف أيضا باسم فيتامين H - هو جزيء صغير قابل للذوبان في الماء. من المشتقين الشائعين الاستخدام من البيوتين لتجارب وضع العلامات على السطح هو السلفو-NHS-SS-البيوتين ، والذي يتكون من مجموعة السلفو ، ومجموعة إستر N-hydroxy succinimide ، ورابطة ثاني كبريتيد ، وبالطبع البيوتين. دعونا نبسط هذا الهيكل الضخم عن طريق استبدال البيوتين بالحرف "B."

تضفي مجموعة السلفو في هذا الهيكل شحنة قوية تجعل هذا النوع من غشاء البيوتين غير منفذ. يتم وضع العلامات على بروتينات سطح الخلية عن طريق إضافة سلفو-NHS-SS-البيوتين إلى الخلايا التي يتم الاحتفاظ بها عند درجة حرارة تقيد الالتقام الخلوي. تتفاعل مجموعة NHS مع الأمينات الأولية على البروتينات السطحية ، وتشكل روابط تساهمية.

بعد ذلك ، يتم نقل الخلايا المصنفة إلى درجة حرارة مسموح بها للالتقام الخلوي ، حيث سيتم استيعاب بعض البروتينات المصنفة. أخيرا ، يتم إعادة الخلايا إلى درجة الحرارة المقيدة لوقف الالتقام الخلوي. من أجل تحديد البروتينات الداخلية على وجه التحديد ، تمت إضافة عامل اختزال محب للماء غير منفذة للغشاء - مثل L-glutathione. سيتفاعل هذا مع روابط ثاني كبريتيد على البيوتين السلفو-NHS-SS غير الخلوي ، ويشق مجموعات البيوتين. في هذه المرحلة ، البروتينات البيوتينيل المتبقية هي تلك التي تمت حماية ملصقاتها من عامل الاختزال لأنها كانت داخلية مسبقا.

ثم يتم تحلل الخلايا ، ويتم عزل البروتينات الحيوية المضمنة للخلايا ليتم قياسها كميا. عادة ما يتم إجراء العزل عن طريق إضافة محللات الخلايا إلى الخرز الاصطناعي المطلي بالستربتافيدين. نظرا لأن الستربتافيدين له تقارب كبير للغاية مع البيوتين ، فإن البروتينات الحيوية تلتصق بالخرز المطلي. يتم تنفيذ سلسلة من خطوات الغسيل لإزالة البروتينات الملوثة ، وأخيرا خطوة الشطف ، لإطلاق البروتينات المقيدة. يمكن بعد ذلك تحليل البروتينات المستهدفة بتقنيات مثل النشاف الغربي.

نظرا لأنك تعرف الآن المفاهيم الكامنة وراء مقايسة البيوتينيل ، فلنلق نظرة على بروتوكول معمم يوضح كيفية تنفيذ هذا الإجراء لقياس الالتقام الخلوي للبروتينات السطحية.

ابدأ بالخلايا المستنبتة المبردة إلى 4 درجات مئوية. ضعها على الجليد للحفاظ على درجة الحرارة المقيدة للالتقام الخلوي. بعد ذلك ، تتم إضافة كاشف السلفو-NHS-SS-البيوتين غير المنفذ للغشاء ، ويتم تحضين الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة تقريبا. يتيح ذلك وقتا كافيا لملصقات البيوتين للالتصاق تساهميا بالبروتينات السطحية. ثم تتم إزالة الخلايا من الجليد وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا. عند درجة الحرارة هذه ، يتم التحصين داخل البروتينات السطحية الحيوية. بعد الحضانة ، يتم تبريد الخلايا إلى 4 درجات مئوية ، ويضاف عامل اختزال محب للماء مثل L-glutathione. يتفاعل هذا مع روابط ثاني كبريتيد ويطلق مجموعات البيوتين من البروتينات غير المحفوظة للخلايا الداخلية.

بعد ذلك ، يتم تحلل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وبالتالي تكسير أغشية الخلايا وتعريض البروتينات الحيوية. بعد ذلك ، تضاف المحللات إلى الخرز المطلي بالستربتافيدين ويسمح للبروتينات الحيوية بالارتباط. يتم غسل الخرزات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد ويتم شطبها بمحلول احترازي يحتوي على المنظفات وعوامل الاختزال. تقوم هذه الكواشف بتغيير طبيعة البروتينات المرتبطة من الخرز وتمكين استعادتها في الشطف. يتم فصل البروتينات الموجودة في الشطف على أساس كتلتها الجزيئية بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام. أخيرا ، يسمح النشاف الغربي وفحص اللطخة بالأجسام المضادة الخاصة بالبروتين بتصور البروتين المستهدف. يمكن قياس النسبة المئوية للبروتين الخلوي من كثافة النطاق الناتجة.

الآن بعد أن فهمت منهجية البيوتينيل الخلوي ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدامها في تجارب محددة.

التطبيق الأكثر شيوعا لبروتوكول البيوتينيل هذا هو قياس معدل الخلية الداخلية لبروتينات سطح خلية معينة. هنا ، كان العلماء مهتمين بتقييم استيعاب ناقل الدوبامين أو DAT. باتباع البروتوكول القياسي ، تمكن العلماء من قياس النسبة المئوية ل DATs الداخلية للخلايا الداخلية. هذه لطخة مناعية تمثيلية تظهر حارة T ، تتوافق مع الكمية "الإجمالية" من البروتين قبل الاستيعاب ، والممر S مخصص للعينات "المجردة" حيث لم يسمح للخلايا بالمضي قدما من خلال الالتقام الخلوي ولكن تم معالجتها بعامل اختزال ، ويمثل الممر الأول نتائج البروتينات "الداخلية".

بالإضافة إلى مجرد قياس الالتقام الخلوي للبروتينات السطحية ، يفحص العلماء أيضا تأثيرات الأدوية على هذه العملية. في هذه الدراسة ، قام الباحثون بتقييم كثافة سطح DATs استجابة للعلاج بمنشط بروتين كيناز C (PKC) ، والذي تم اقتراح عمله للحث على استيعاب DAT. أكد العلماء ذلك من خلال تكييف بروتوكول البيوتينيل في المختبر للاستخدام في اختبار خارج الجسم الحي على أنسجة دماغ الفأر. كشفت البيانات عن فقدان ما يقرب من 30٪ من DAT من غشاء الخلية ، استجابة لتنشيط PKC.

أخيرا ، من خلال تعديل مقايسة البيوتينيل ، يمكن للعلماء أيضا قياس إعادة تدوير بروتينات الغشاء. هنا ، كان الباحثون يحققون في بروتين القناة السطحية ، CFTR ، المسؤول عن توصيل أيونات الكلوريد. لتقييم إعادة التدوير ، أجرى الباحثون بروتوكولا قياسيا للبيوتينيل في مجموعة واحدة من الخلايا ، وقاموا بتعديل البروتوكول للمجموعة الثانية من الخلايا عن طريق إضافة خطوات بعد شق البيوتين عن البروتينات السطحية غير الخلوية. تضمنت هذه الخطوات الإضافية رفع درجة الحرارة مرة أخرى إلى 37 درجة مئوية للسماح بإعادة تدوير بعض بروتينات المستقبلات الداخلية التي تحمل علامة البيوتين. من خلال حساب الفرق بين البروتينات الداخلية قبل وبعد إعادة التدوير ، تمكن هؤلاء العلماء من تحديد النسبة المئوية ل CFTR المعاد تدويرها مرة أخرى إلى الغشاء.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لمقايسة البيوتينيل على سطح الخلية. وصف الفيديو الخطوات الإجرائية لهذا الفحص ، وشرح رد الفعل الذي يحدث في كل خطوة. أخيرا ، استكشفنا بعض الأمثلة على التجارب التي أثبتت قابلية تطبيق هذه الطريقة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

يمكن للخلية تنظيم كمية بروتينات معينة على غشاء الخلية من خلال الالتقام الخلوي ، وبعد ذلك يتم عزل بروتينات سطح الخلية بشكل فعال في السيتوبلازم. بمجرد د…