تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية
January 16th, 2018
مؤخرا نحن تعيين المواقع المكانية (3D) ثلاثي الأبعاد من طرق النقل لمختلف البروتينات ترانسلوكاتينج داخل أهداب الأساسية في الخلايا الحية. هنا تعيش هذه الورقة تفاصيل تطبيق الإعداد التجريبية والعملية للعينات البيولوجية وتحليل البيانات للأسفار 3D القرار العظمى التصوير نهجاً حديثا في أهداب الأولية.
الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد طرق نقل البروتين في الأهداب الأولية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال الأهداب ، مثل اختلافات مسار نقل البروتين في الأهداب الطبيعية والمختلة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتمتع بدقة عالية بما يكفي لرؤية طرق نقل البروتين تحت الحيود في الخلايا الحية.
للبدء ، قم بإذابة الجليد المجمد من خلايا NIH-3T3 المصممة خصيصا عند 37 درجة مئوية ، بعد أسبوع ونصف من التجربة. انقل الخلايا المذابة إلى قارورة مزروعة بالخلايا بحجم 25 سم مربع تحتوي على ثلاثة ملليلتر من الوسائط الدافئة مسبقا. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى 80٪ من التقاء ثم قم بتقسيم الخلايا. من أجل تقسيم الخلايا ، قم بتربسينية بنسبة 0.25٪ تريبسين لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة القصيرة ، استنشق التربسين واستبدله بملليلترين من وسائط الاستزراع الدافئة مسبقا.
قم بضرب الوسائط لتفكيك أي مجموعات خلايا ، ثم قم بإزالة 75٪ من الخلايا من القارورة وإعادة الحجم الإجمالي للوسائط إلى ثلاثة ملليلترات. قم بتقسيم الخلايا ثلاث مرات على الأقل قبل التجربة لضمان تجانس دورة خلياتها. قبل يومين من التجربة ، قم بتقسيم الخلايا ووضعها 60-70٪ على صفيحة سفلية زجاجية مقاس 35 ملم مع 1.5 مل من نفس وسط الاستزراع.
ثم ، قبل يوم واحد من التجربة ، قم بنقل الخلايا كيميائيا باستخدام البلازميد المطلوب. امزج 500-1000 نانوجرام من البلازميد بنسبة واحد إلى 2.5 مع كاشف التعدي و 0.25 مل من وسائط المصل المختزلة بدون مضادات حيوية لمدة 30 دقيقة. بمجرد تكوين مركب التعدي ، استنشق الوسائط من الطبق السفلي الزجاجي مقاس 35 ملم واستبدله بخليط تعداء 0.25 ملم و 1.25 ملم إضافي من وسائط المصل المخفضة بدون مضادات حيوية وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
بالنسبة للخلايا ذات البنية SSTR3 المسمى خارجيا ، قم بإزالة الوسائط من الطبق السفلي الزجاجي قبل ساعة واحدة من التجربة. اغسل الخلايا خمس مرات بمليلتر واحد من PBS وأضف ملليلترا واحدا من وسائط المصل المختزلة المكملة بميكرومولار واحد من الستربتافيدين المترافق Alexa 647. قبل التجربة بمدة لا تزيد عن 15 دقيقة ، قم بإزالة الوسائط من الطبق السفلي الزجاجي واغسل الخلايا خمس مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS.
ثم أضف ملليلترا واحدا من مخزن التصوير المؤقت إلى الطبق السفلي الزجاجي. قم بلصق اللوحة السفلية الزجاجية على المسرح في المجهر. ابحث عن خلية GFP Express باستخدام مجموعة مرشح GFP وحدد موقع خلية تعبر بشكل صحيح عن SSTR3-GFP في أهداب أولية.
بمجرد العثور على خلية مناسبة ، قم بمحاذاة بقعة NPHP4-mCherry في قاعدة الأهداب الأولية مع الموقع على مستوى التصوير الذي يتوافق مع إضاءة النقطة المفردة لليزر. باستخدام وظيفة الالتقاط ، في علامة تبويب الكاميرا في نافذة عناصر التحكم في التركيز البؤري ، التقط صورة فائقة التألق لبروتينات NPHP4-mCherry و SSTR3 الموسومة ببروتين مضان أخضر. بمجرد الحصول على الصور المرجعية ، قلل محليا من تركيز الجزيئات المفردة المصنفة عن طريق التبييض الضوئي للمنطقة الانتقالية بإضاءة ليزر مللي واط واحدة لمدة 20 ثانية.
للتحضير لتتبع الجزيء الفردي ، قلل طاقة إضاءة الليزر إلى 0.5 مللي واط للجزيئات المسماة ب Alexa 647. اضبط الكسب والتكثيف على الحد الأقصى ومعدل الإطارات على مللي ثانية. ثم انقر فوق زر البث في علامة تبويب الكاميرا في نافذة عناصر التحكم في التركيز وقم بتشغيل ليزر الإضاءة المناسب.
سجل الجزيئات المفردة غير المبيضة الضوئية أثناء نقلها عبر المنطقة المبيضة الضوئية للمنطقة الانتقالية. وتذكر ألا تسجل أكثر من دقيقتين من الفيديو لتجنب آثار الانجراف الهدبي. بعد التقاط الجزيئات المفردة ، قم بمعالجة مقاطع الفيديو باستخدام خوارزمية تركيب Gaussian ثنائية الأبعاد مثل لمحة بواسطة مختبر Gelles ، والتي تقوم بدقة بتحديد موقع نقطة الإثارة لكل جزيء ، ووظيفة الانتشار ، ومجال الاهتمام الشامل.
أخيرا ، حدد جميع مواقع الجزيئات المفردة بدقة أفضل من 10 نانومتر وقم بتصحيح مركز الأهداب بناء على توزيع مواقع الجزيء الفردي المزودة بوظيفة غاوسية ثنائية الأبعاد. كما هو موضح في هذا الفيديو ، يمكن استخدام إضاءة أحادية النقطة لتتبع جزيء SSTR3 الموسوم ب AF647 عبر المنطقة الانتقالية المميزة ب NPHP4-mCherry. قبل تحليل البيانات ، يعد تركيب فيديو الجزيء الفردي على إضاءة المجال الواسع خطوة مفيدة للتحقق من الصحة للتأكد من محاذاة الليزر بشكل صحيح ، وأن هناك نسبة إشارة إلى ضوضاء مناسبة.
تم تصويرها هنا خلية ذات هدب أولي تم تحديده بواسطة التلوين. IFT20 هو مكون من مجمع النقل داخل السوط الذي يحمل البضائع على طول الأنابيب الدقيقة داخل الأهداب الأولية ، والتي تتميز ب Arl13b-mCherry. بمجرد تحديده ، يتم استخدام الفحص المجهري السريع لتتبع بروتينات IFT20-GFP الفردية.
بعد ذلك ، يتم استخدام خوارزمية التحويل من 2D إلى 3D لإنتاج توزيع كثافة الاحتمالية المكانية للبروتين داخل الأهداب الأولية على طول بعد واحد. من المحتمل أن تتزامن هذه المنطقة عالية الكثافة مع الأنابيب الدقيقة المحورية بالاتفاق مع الموقع المعروف لطريق النقل داخل السوط. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم محاذاة العينة بدقة مع الليزر لتقليل الخطأ المنهجي.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية القيام بتتبع الجزيء الفردي باستخدام الفحص المجهري السريع وستعرف كيفية الحصول على مسار نقل جزيء واحد في الأهداب الأولية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
تركز هذه الدراسة على رسم خرائط المواقع المكانية ثلاثية الأبعاد (3D) لمسارات نقل البروتين في الأهداب الأولية باستخدام تصوير الفلوريسنس فائق الدقة. يتم توضيح الإعداد التجريبي وتحليل البيانات لتوفير رؤى حول نقل البروتين في الخلايا الحية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- تصوير الفلوريسنس
الخلفية
- تلعب الأهداب الأولية دورًا حاسمًا في الإشارة الخلوية.
- يمكن أن يكشف فهم مسارات نقل البروتين عن الاختلافات بين الأهداب الطبيعية وغير الوظيفية.
- تقنيات التصوير عالية الدقة ضرورية لدراسة هذه العمليات في الخلايا الحية.
- تسهم هذه الأبحاث في فهم أعم لوظيفة الأهداب واختلالها.
غرض الدراسة
- تحديد مسارات نقل البروتين في الأهداب الأولية.
- التحقيق في الاختلافات في مسارات النقل بين الأهداب الطبيعية وغير الوظيفية.
- تطبيق تقنية تصوير جديدة لزيادة الدقة في دراسات الخلايا الحية.
الطرق المستخدمة
- تصوير فائق الدقة بالفلوريسنس ثلاثي الأبعاد.
- تحضير خلايا NIH-3T3 للتصوير الحي.
- إذابة وزراعة الخلايا في ظروف مسيطر عليها.
- تحليل البيانات لرسم خرائط لمسار نقل البروتين.
النتائج الرئيسية
- رسم ناجح لمسارات نقل البروتين في الأهداب الأولية الحية.
- تحديد الاختلافات الرئيسية في مسارات النقل في ظروف مختلفة.
- إظهار فعالية تقنية التصوير.
- رؤى حول ديناميكيات نقل البروتين في الأهداب.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة منظورًا جديدًا لنقل البروتين في الأهداب الأولية.
- يمكن للتصوير عالي الدقة الكشف عن رؤى حاسمة حول وظيفة الأهداب.
- يمكن للبحوث المستقبلية أن تبني على هذه النتائج لاستكشاف اختلال وظيفة الأهداب.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
