أصباغ FM في إعادة تدوير الحويصلة
أصباغ FM هي فئة من جزيئات الفلورسنت التي وجدت استخداما مهما في دراسة عملية إعادة تدوير الحويصلات. بفضل التركيب الكيميائي ، يمكن لهذه الجزيئات إدخال نف…
أصباغ FM هي أصباغ غشائية تستخدم على نطاق واسع لإعادة تدوير الحويصلة. هذه هي العملية التي تشكل بها الخلية حويصلات من غشاءها للحفاظ على حجم الخلية ، وإعادة استخدام البروتينات باهظة الثمن ، ونقل الجزيئات على التوالي إلى الفضاء خارج الخلية. تتم دراسة هذه العملية بشكل شائع في نقاط الاشتباك العصبي ، حيث تشارك في إطلاق الناقلات العصبية. بالإضافة إلى فحص إعادة تدوير الحويصلة ، تستخدم أصباغ FM لدراسة العديد من الظواهر الأخرى ، مثل الإفراز في خلايا الكرومافين وإصلاح غشاء الخلية بعد الإصابة.
سيركز هذا الفيديو على استخدام أصباغ FM في تجربة لدراسة إعادة تدوير الحويصلات. سنستعرض بروتوكولا خطوة بخطوة يستخدم أصباغ FM لتحديد عملية إعادة التدوير في الخلايا العصبية المحفزة. أخيرا ، سنراجع بعض أمثلة التجارب ، التي تستخدم هذا الجزيء الفريد بطرق مختلفة.
قبل القفز إلى الإجراء ، دعنا أولا نراجع الخصائص الكيميائية الحيوية لأصباغ FM ، والتي ستساعدنا على فهم وظيفتها في تجارب إعادة تدوير الحويصلات.
من الناحية الهيكلية ، أصباغ FM هي جزيئات ستايريل تستمد اسمها من العالم الذي صنعها - فاي ماو. هذه الأصباغ لها ثلاث سمات هيكلية رئيسية: الرأس والذيل والجسر. يتكون الجسر من حلقتين عطريتين مع منطقة رابطة مزدوجة متغيرة بينهما. هذا القسم بأكمله يخلق الفلوروفور.
إنها طبيعة أي فلوروفور أنه عندما يصطدم بالضوء الوارد بطول موجي معين للإثارة ، تمتص ذراته تلك الطاقة وترفع إلكتروناتها إلى حالة مثارة. تعود هذه الإلكترونات إلى الحالة الأرضية عن طريق انبعاث الطاقة بشكل اهتزازي ، وأخيرا كضوء بطول موجة انبعاث. يسمح الذيل الكارهة للماء لجزيء FM بالتقسيم إلى طبقات ثنائية الدهون لغشاء الخلية ، ورأسه المحب للماء له شحنة تقيد توطينه في نشرة الغشاء الخارجي.
لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة التي يمكن أن تدخل بها الخلية هي عن طريق الالتقام الخلوي. أصباغ FM حساسة بشكل حاد للبيئة ، وتظهر مضان ضعيفا في المذيبات القطبية ، ولكنها مضان قوي في البيئات الكارهة للماء مثل الأغشية. يؤدي ذلك إلى وضع علامات غشائية عالية التباين يمكن تصورها وقياسها كميا باستخدام مجهر فلوري.
هذه الخصائص تجعل أصباغ FM مناسبة خصيصا لتقييم إعادة تدوير الحويصلات في نقاط الاشتباك العصبي. باختصار ، تتضمن العملية احتضان الثقافات بصبغة FM. ترتبط بعض جزيئات FM بالأغشية ، مما يزيد بشكل كبير من شدة التألق. بعد ذلك ، يبدأ المنبه عملية استيعاب الغشاء. لذلك ، يتم احتجاز بعض جزيئات FM في غشاء الحويصلة ، ويتم غسل بقية جزيئات الصبغة الموضعية الخارجية.
عند التحفيز الثاني ، تندمج الحويصلات الملطخة الداخلية مع غشاء الخلية لإطلاق محتوياتها ، وتتفكك الصبغة بسرعة ، مما يؤدي إلى انخفاض سريع في شدة التألق. يمكن قياس هذا الإزالة بمساعدة المجهر الفلوري.
الآن بعد أن أصبحت على دراية بالمبادئ الكيميائية الحيوية لأصباغ FM ، دعنا نراجع إجراء حول كيفية إجراء تجربة لفحص إعادة تدوير الحويصلة المشبكية باستخدام هذه الأصباغ.
يتم تحضير عينات نظيفة وصحية من الثقافات العصبية على أغطية مسبقا. يتم نقل هذه الخلايا إلى محلول صبغة FM ، مما يتسبب في تسمية الأغشية. ثم يتم تثبيت غطاء العينة على غرفة التصوير بالمجهر.
للسماح بمعالجة السوائل مثل الغسيل ، يتم إرفاق خطوط إدخال وإخراج السوائل لتشكيل غرفة نضح محكمة الغلق. قم بتركيب الغرفة على مسرح المجهر الفلوري. قم بتوصيل الأسلاك بالغرفة وتوصيلها بالمحفز الكهربائي. بمجرد توصيلها ، يتم ضبط مرشحات الإثارة والانبعاث وفقا لصبغة FM المستخدمة.
يتم تحفيز تحميل الصبغة في الحويصلات عن طريق الالتقام الخلوي باستخدام التحفيز الكهربائي. بعد التحفيز ، يسمح للأطراف العصبية بالتعافي. ثم يتم غسل الصبغة خارج الخلية بمخزن مؤقت. هذا يقلل أيضا من مضان الخلفية. من المهم الحفاظ على شدة الإثارة في الحد الأدنى لأن أصباغ FM عرضة للتبييض الضوئي ، مما يؤدي إلى إضعاف شدة التألق بسبب الإثارة لفترات طويلة. بعد الحضانة القصيرة ، يتم الحصول على الصور الأولية. بعد ذلك ، يتم إحداث الإفراز الخلوي بإشارة كهربائية ثانية.
بعد قياس التألق في نقاط زمنية مختلفة بعد التحفيز ، في النهاية ، يمكن تحفيز الأطراف العصبية بشكل شامل لتفريغ جميع الصبغة القابلة للانطلاق. يعتبر التألق المتبقي بعد ذلك شدة مضان الخلفية. بعد ذلك ، يتم قياس التألق الجوهري لكل صورة باستخدام أداة "منطقة الاهتمام" في منطقة غير متشابكة من الصورة. ثم يتم طرح مضان الخلفية والتألق الجوهري من شدة التألق لكل نقطة زمنية للحصول على شدة التألق الطبيعي ، والتي يتم رسمها بعد ذلك مقابل الوقت. يمثل الانخفاض في الشدة بمرور الوقت إزالة البقع ، وهو مقياس غير مباشر لإعادة تدوير الحويصلات.
الآن بعد أن راجعنا المنهجية ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام أصباغ FM في تجارب محددة.
ناقشنا البروتوكول باستخدام أصباغ FM في الخلايا العصبية المحفزة. هنا ، كان العلماء مهتمين بدراسة إعادة تدوير الحويصلة التلقائية. لقد فعلوا ذلك باستخدام البروتوكول المعمول به مع نظام تصوير حساس بما يكفي لاكتشاف التغييرات الصغيرة في شدة التألق. تمثل النتائج انخفاضا في شدة التألق يرجع مباشرة إلى الإطلاق المشبكي التلقائي.
داخل الخلايا العصبية قبل المشبكية ، تنقسم الحويصلات إلى مجموعتين: تجمع احتياطي أو RP ، وتجمع يمكن إطلاقه بسهولة أو RRP. هنا ، استخدم العلماء أصباغ FM لتحليل جزء كل نوع في مجموعة الحويصلات. من خلال التطبيق المتسلسل للمنبهات الكهربائية ذات الشدة المتزايدة ، تمكن هؤلاء العلماء من تحديد النسب المئوية النسبية لكل نوع من أنواع تجمع الحويصلات.
أخيرا ، يستخدم عالم الأحياء الخلوية أيضا أصباغ FM لتشريح العوامل المشاركة في الإصلاح الخارجي لأغشية البلازما المصابة. في هذه التجربة ، ركز الباحثون بشكل خاص على دور sphingomyelinase ، وهو إنزيم معدل للدهون ، في عملية إعادة إغلاق الغشاء. أولا ، قاموا بتوليد خلايا تعاني من نقص في إنزيم sphingomyelinase بمساعدة إسكات علاج الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، عالجوا هذه الخلايا ومجموعة تحكم بصبغة FM خارجية وسم يخلق آفات غشاء البلازما. أخيرا ، شاهدوا جميع العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. أظهرت النتائج أن الخلايا التي تعاني من نقص السفينغوميليناز أظهرت تراكما قويا لجزيئات FM داخل الخلايا. من ناحية أخرى ، أظهرت خلايا التحكم الحد الأدنى من تدفق FM ، مما يشير إلى دور sphingomyelinase في إصلاح غشاء البلازما.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول أصباغ FM في إعادة تدوير الحويصلة. وصف الفيديو الكيمياء الحيوية لأصباغ FM ، وفصل بروتوكولا لصبغة وتحديد إعادة تدوير الحويصلة المشبكية ، وأخيرا حدد التجارب الحالية التي تستخدم هذه الأصباغ بطرق مختلفة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
أصباغ FM هي أصباغ غشائية تستخدم على نطاق واسع لإعادة تدوير الحويصلة. هذه هي العملية التي تشكل بها الخلية حويصلات من غشاءها للحفاظ على حجم الخلية ، وإعادة استخدام البروتينات باهظة الثمن ، ونقل الجزيئات على التوالي إلى الفضاء خارج الخلية. تتم دراسة هذه العملية بشكل شائع في نقاط الاشتباك العصبي ، حيث تشارك في إطلاق الناقلات العصبية. بالإضافة إلى فحص إعادة تدوير الحويصلة ، تستخدم أصباغ FM لدراسة العديد من الظواهر الأخرى ، مثل الإفراز في خلايا الكرومافين وإصلاح غشاء الخلية بعد الإصابة.
سيركز هذا الفيديو على استخدام أصباغ FM في تجربة لدراسة إعادة تدوير الحويصلات. سنستعرض بروتوكولا خطوة بخطوة يستخدم أصباغ FM لتحديد عملية إعادة التدوير في الخلايا العصبية المحفزة. أخيرا ، سنراجع بعض أمثلة التجارب ، التي تستخدم هذا الجزيء الفريد بطرق مختلفة.
قبل القفز إلى الإجراء ، دعنا أولا نراجع الخصائص الكيميائية الحيوية لأصباغ FM ، والتي ستساعدنا على فهم وظيفتها في تجارب إعادة تدوير الحويصلات.
من الناحية الهيكلية ، أصباغ FM هي جزيئات ستايريل تستمد اسمها من العالم الذي صنعها - فاي ماو. هذه الأصباغ لها ثلاث سمات هيكلية رئيسية: الرأس والذيل والجسر. يتكون الجسر من حلقتين عطريتين مع منطقة رابطة مزدوجة متغيرة بينهما. هذا القسم بأكمله يخلق الفلوروفور.
إنها طبيعة أي فلوروفور أنه عندما يصطدم بالضوء الوارد بطول موجي معين للإثارة ، تمتص ذراته تلك الطاقة وترفع إلكتروناتها إلى حالة مثارة. تعود هذه الإلكترونات إلى الحالة الأرضية عن طريق انبعاث الطاقة بشكل اهتزازي ، وأخيرا كضوء بطول موجة انبعاث. يسمح الذيل الكارهة للماء لجزيء FM بالتقسيم إلى طبقات ثنائية الدهون لغشاء الخلية ، ورأسه المحب للماء له شحنة تقيد توطينه في نشرة الغشاء الخارجي.
لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة التي يمكن أن تدخل بها الخلية هي عن طريق الالتقام الخلوي. أصباغ FM حساسة بشكل حاد للبيئة ، وتظهر مضان ضعيفا في المذيبات القطبية ، ولكنها مضان قوي في البيئات الكارهة للماء مثل الأغشية. يؤدي ذلك إلى وضع علامات غشائية عالية التباين يمكن تصورها وقياسها كميا باستخدام مجهر فلوري.
هذه الخصائص تجعل أصباغ FM مناسبة خصيصا لتقييم إعادة تدوير الحويصلات في نقاط الاشتباك العصبي. باختصار ، تتضمن العملية احتضان الثقافات بصبغة FM. ترتبط بعض جزيئات FM بالأغشية ، مما يزيد بشكل كبير من شدة التألق. بعد ذلك ، يبدأ المنبه عملية استيعاب الغشاء. لذلك ، يتم احتجاز بعض جزيئات FM في غشاء الحويصلة ، ويتم غسل بقية جزيئات الصبغة الموضعية الخارجية.
عند التحفيز الثاني ، تندمج الحويصلات الملطخة الداخلية مع غشاء الخلية لإطلاق محتوياتها ، وتتفكك الصبغة بسرعة ، مما يؤدي إلى انخفاض سريع في شدة التألق. يمكن قياس هذا الإزالة بمساعدة المجهر الفلوري.
الآن بعد أن أصبحت على دراية بالمبادئ الكيميائية الحيوية لأصباغ FM ، دعنا نراجع إجراء حول كيفية إجراء تجربة لفحص إعادة تدوير الحويصلة المشبكية باستخدام هذه الأصباغ.
يتم تحضير عينات نظيفة وصحية من الثقافات العصبية على أغطية مسبقا. يتم نقل هذه الخلايا إلى محلول صبغة FM ، مما يتسبب في تسمية الأغشية. ثم يتم تثبيت غطاء العينة على غرفة التصوير بالمجهر.
للسماح بمعالجة السوائل مثل الغسيل ، يتم إرفاق خطوط إدخال وإخراج السوائل لتشكيل غرفة نضح محكمة الغلق. قم بتركيب الغرفة على مسرح المجهر الفلوري. قم بتوصيل الأسلاك بالغرفة وتوصيلها بالمحفز الكهربائي. بمجرد توصيلها ، يتم ضبط مرشحات الإثارة والانبعاث وفقا لصبغة FM المستخدمة.
يتم تحفيز تحميل الصبغة في الحويصلات عن طريق الالتقام الخلوي باستخدام التحفيز الكهربائي. بعد التحفيز ، يسمح للأطراف العصبية بالتعافي. ثم يتم غسل الصبغة خارج الخلية بمخزن مؤقت. هذا يقلل أيضا من مضان الخلفية. من المهم الحفاظ على شدة الإثارة في الحد الأدنى لأن أصباغ FM عرضة للتبييض الضوئي ، مما يؤدي إلى إضعاف شدة التألق بسبب الإثارة لفترات طويلة. بعد الحضانة القصيرة ، يتم الحصول على الصور الأولية. بعد ذلك ، يتم إحداث الإفراز الخلوي بإشارة كهربائية ثانية.
بعد قياس التألق في نقاط زمنية مختلفة بعد التحفيز ، في النهاية ، يمكن تحفيز الأطراف العصبية بشكل شامل لتفريغ جميع الصبغة القابلة للانطلاق. يعتبر التألق المتبقي بعد ذلك شدة مضان الخلفية. بعد ذلك ، يتم قياس التألق الجوهري لكل صورة باستخدام أداة "منطقة الاهتمام" في منطقة غير متشابكة من الصورة. ثم يتم طرح مضان الخلفية والتألق الجوهري من شدة التألق لكل نقطة زمنية للحصول على شدة التألق الطبيعي ، والتي يتم رسمها بعد ذلك مقابل الوقت. يمثل الانخفاض في الشدة بمرور الوقت إزالة البقع ، وهو مقياس غير مباشر لإعادة تدوير الحويصلات.
الآن بعد أن راجعنا المنهجية ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام أصباغ FM في تجارب محددة.
ناقشنا البروتوكول باستخدام أصباغ FM في الخلايا العصبية المحفزة. هنا ، كان العلماء مهتمين بدراسة إعادة تدوير الحويصلة التلقائية. لقد فعلوا ذلك باستخدام البروتوكول المعمول به مع نظام تصوير حساس بما يكفي لاكتشاف التغييرات الصغيرة في شدة التألق. تمثل النتائج انخفاضا في شدة التألق يرجع مباشرة إلى الإطلاق المشبكي التلقائي.
داخل الخلايا العصبية قبل المشبكية ، تنقسم الحويصلات إلى مجموعتين: تجمع احتياطي أو RP ، وتجمع يمكن إطلاقه بسهولة أو RRP. هنا ، استخدم العلماء أصباغ FM لتحليل جزء كل نوع في مجموعة الحويصلات. من خلال التطبيق المتسلسل للمنبهات الكهربائية ذات الشدة المتزايدة ، تمكن هؤلاء العلماء من تحديد النسب المئوية النسبية لكل نوع من أنواع تجمع الحويصلات.
أخيرا ، يستخدم عالم الأحياء الخلوية أيضا أصباغ FM لتشريح العوامل المشاركة في الإصلاح الخارجي لأغشية البلازما المصابة. في هذه التجربة ، ركز الباحثون بشكل خاص على دور sphingomyelinase ، وهو إنزيم معدل للدهون ، في عملية إعادة إغلاق الغشاء. أولا ، قاموا بتوليد خلايا تعاني من نقص في إنزيم sphingomyelinase بمساعدة إسكات علاج الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، عالجوا هذه الخلايا ومجموعة تحكم بصبغة FM خارجية وسم يخلق آفات غشاء البلازما. أخيرا ، شاهدوا جميع العينات باستخدام مجهر متحد البؤر. أظهرت النتائج أن الخلايا التي تعاني من نقص السفينغوميليناز أظهرت تراكما قويا لجزيئات FM داخل الخلايا. من ناحية أخرى ، أظهرت خلايا التحكم الحد الأدنى من تدفق FM ، مما يشير إلى دور sphingomyelinase في إصلاح غشاء البلازما.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول أصباغ FM في إعادة تدوير الحويصلة. وصف الفيديو الكيمياء الحيوية لأصباغ FM ، وفصل بروتوكولا لصبغة وتحديد إعادة تدوير الحويصلة المشبكية ، وأخيرا حدد التجارب الحالية التي تستخدم هذه الأصباغ بطرق مختلفة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are FM dyes and how do they work in membrane imaging?
FM dyes are styryl fluorescent molecules that insert into the outer leaflet of cell membranes. They fluoresce strongly in hydrophobic environments like lipid bilayers but weakly in polar solvents, creating high-contrast membrane labeling. When struck by excitation light, their electrons enter an excited state and emit light at a specific wavelength, enabling visualization under a fluorescence microscope.
Q2: Why can FM dyes only enter cells through endocytosis?
FM dyes have a hydrophilic, charged head group that restricts their localization to the outer membrane leaflet. This charge prevents the molecule from crossing the lipid bilayer directly. The only way FM dyes can reach the cell interior is via endocytosis and exocytosis, the processes by which cells internalize and recycle membrane vesicles containing the dye molecules.
Q3: How does FM dye fluorescence change during vesicle recycling?
During vesicle recycling, FM dye fluorescence increases when dye-labeled membranes are internalized into vesicles, trapping the dye in the hydrophobic environment. Upon exocytosis, vesicles fuse with the cell membrane and the dye rapidly departitions into the extracellular space, causing a sharp decrease in fluorescence intensity that can be quantified to measure recycling rates.
Q4: What is photobleaching and why is it a concern in FM dye experiments?
Photobleaching is the weakening of fluorescence intensity caused by prolonged exposure to excitation light. FM dyes are particularly prone to photobleaching, so researchers minimize excitation intensity during imaging to preserve signal. This precaution ensures accurate quantification of destaining and prevents loss of fluorescence data before measurements are complete.
Q5: How are vesicle pools distinguished using FM dyes in neurons?
Scientists apply sequential electrical stimuli of increasing intensities to neurons labeled with FM dyes. This approach allows them to quantify the relative percentages of the reserve pool and readily releasable pool of synaptic vesicles. The differential destaining patterns reveal how many vesicles are available for immediate release versus those held in reserve.
Q6: What does normalized fluorescence intensity reveal about vesicle recycling?
Normalized fluorescence intensity is calculated by subtracting background and intrinsic fluorescence from raw intensity measurements at each time point. When plotted over time, the decrease in normalized intensity represents destaining, which serves as an indirect measure of vesicle recycling. This quantification allows researchers to assess the rate and extent of membrane internalization and recycling.
Q7: How do FM dyes help identify the role of sphingomyelinase in membrane repair?
Researchers compared FM dye uptake in sphingomyelinase-deficient cells versus control cells after inducing plasma membrane lesions. Sphingomyelinase-deficient cells showed robust intracellular FM accumulation, while controls showed minimal influx. This difference demonstrated that sphingomyelinase plays a critical role in the exocytic repair process that normally seals membrane wounds.