نموذج تروفوبلست بشرية الأولية لدراسة تأثير التهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات على تنظيم أوتوفاجي في المشيمة

الهدف العام من نموذج زراعة خلايا الأرومة الغاذية هذا هو قياس تأثير الالتهاب المرتبط بالسمنة على تنظيم المسارات الحرجة في الأرومات الغاذية. الميزة الرئيسية لنظام التحكم هذا هي أنه يؤسس علاقة بين التهاب نخر الورم ألفا وتنظيم الجينات في المشيمة في سياق السمنة الأمهات. الميزة الرئيسية لهذا النظام التجريبي هي أنه يؤسس علاقات بين الالتهاب بوساطة عامل نخر الورم ألفا وتنظيم الجينات في المشيمة في سياق السمنة الأمومة.

سيوضح الإجراء بيلي سيمون ومات بوشر ، فنيان من مختبري. يجب أخذ عينات من الأنسجة الزبدية من المشيمة في أسرع وقت ممكن بعد الولادة ، ويفضل أن يكون ذلك في غضون 30 دقيقة أو أقل. مع توجيه الصفيحة المشيمية لأعلى ، استخدم الملقط والمقص لاستئصال قسمين إلى ثلاثة أقسام كاملة السماكة ، بشكل عشوائي ، من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات من محيط المشيمة.

تجنب أجزاء المشيمة التي تبدو غير طبيعية. قم بقص الصفائح المشيمية والقاعدية وأي أوعية دموية كبيرة. ضع الأنسجة الزغبية الناتجة في وسط دافئ وكامل.

في غضون 30 دقيقة من أخذ عينات من الأنسجة الزغابية ، ابدأ في عزل الأرومة الغاذية. ضع كل قطعة من الأنسجة الزغبية في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء بنظام PBS بدرجة حرارة الغرفة وحركه برفق لإطلاق الدم الزائد في الأنسجة. صب PBS واستبداله ب PBS الطازج.

كرر شطف PBS حتى تتم إزالة معظم الدم الزائد. سيكون شطف PBS أحمر فاتح أو وردي عند شطف الأنسجة جيدا. ضع الأنسجة الزغابية في طبق بتري معقم وقم بإزالة أكبر عدد ممكن من الأوعية الدموية باستخدام شريحة مجهرية لكشط الأنسجة الزغابية الرخوة برفق من الأوعية.

باستخدام المقص ، قم بفرم الأنسجة الزغبية الناتجة. انقل الأنسجة الزغابية المفرومة إلى زجاجة معقمة بمحلول هضم وفقا للأحجام المحسوبة بناء على النشاط المحدد للتربسين و DNase. احتضن زجاجة الهضم في حمام مائي 37 درجة مئوية مع رج عند 70 دورة في الدقيقة لمدة 35 دقيقة.

بعد 35 دقيقة ، قم بإمالة زجاجة الهضم على جانبها واترك قطع الأنسجة غير المهضومة تستقر في قاع الزجاجة. ارسم المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مصلية ، وتجنب الأنسجة المستقرة. قم بتوزيع المادة الطافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون بالتساوي بين 50 مليلتر أنابيب مخروطية.

ابدأ عملية الهضم الثانية بإضافة محلول الهضم إلى الأنسجة المستقرة المتبقية واحتضان الزجاجة في حمام مائي 37 درجة مئوية. ضع طبقة برفق من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من مصل ربلة الساق حديثي الولادة ، أو NCS ، أسفل المادة الطافية المتوترة من عملية الهضم الأولى عن طريق الاستغناء ببطء عن ماصة مصلية في قاع الأنبوب. يجب أن يكون الغضروف المفصلي بين المادة الطافية المتوترة التي تحتوي على الأرومات الغاذية و NCS مرئيا.

جهاز الطرد المركزي للطاقات فوق NCS عند 1 ، 250 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ستشمل الحبيبات الناتجة خلايا الدم الحمراء في الطبقة السفلية ، تليها طبقة بيضاء تحتوي على خلايا الأرومة الغاذية. بنفس الطريقة ، قم بتصفية المادة الطافية من الهضم الثاني والثالث.

ضع طبقة NCS أسفل المادة الطافية المتوترة وجهاز الطرد المركزي عند 1 ، 250 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بمجرد أن يتم طرد جميع المواد الطافية وإزالة الطبقات الطافية والمواد الطافية ، أعد تعليق كل حبيبات في خمسة ملليلتر من الوسط الدافئ الكامل ثم قم بتجميع المعلقات. قسم معلق الخلية بالتساوي بين أنبوبين مخروطيين سعة 50 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 250 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية برفق وأعد تعليق كل حبيبات الخلية في ستة ملليلتر من الوسط الدافئ والكامل. لبدء هذا الإجراء، قسم معلق الخلية بالتساوي بين أربعة تدرجات كثافة باستخدام ماصة نقل لوضع طبقة معلق الخلية ببطء وبعناية فوق تدرجات الكثافة. جهاز الطرد المركزي تدرجات الكثافة عند 1 ، 250 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الحد الأدنى من التسارع والتباطؤ.

يجب أن ينتج عن هذا نطاقات مميزة من الخلايا الترسيبة. قم بإزالة الطبقة العليا من وسائط التدرج الكثافة ببطء وحذر حتى يتم الوصول إلى الشريط المعتم الذي يحتوي على خلايا الأرومة الغاذية. انقل أشرطة الأرومة الغاذية إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 مليلتر واملأها بوسط دافئ وكامل.

اقلب الأنابيب برفق ثلاث إلى ست مرات للخلط والطرد المركزي عند 1 ، 250 مرة جم عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات خلية في خمسة ملليلتر من الوسط الدافئ والكامل. اجمع بين معلقات الخلايا وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم والتريبان الأزرق.

الخطوة التالية بعد عد الخلايا هي صفيحة الخلايا. لوحة ثلاثة ملايين خلية لكل بئر في كل ستة ألواح آبار. هز اللوحة برفق ذهابا وإيابا ومن جانب إلى آخر لتوزيع الخلايا بالتساوي.

اترك الخلايا المطلية في فتحة التدفق الصفحي لمدة 30 دقيقة تقريبا للسماح للخلايا بالتوزيع بالتساوي والاستقرار والبدء في الالتصاق بقاع الآبار. بعد 30 دقيقة ، ضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. افحص الأرومات الغاذية تحت المجهر بعد 24 ساعة من الثقافة للتأكد من التعلق ومورفولوجيا الأرومة الغاذية المناسبة.

يمكن علاج الخلايا بعد 24 ساعة من الزراعة. استنشق وسط الثقافة من الخلايا واستبدلها بملليلترين من عامل نخر الورم ألفا المكملة وسط لكل بئر. أعد الألواح إلى حاضنة 37 درجة مئوية.

بعد 24 ساعة من التعرض لعامل نخر الورم ألفا ، استبدل الوسط المكمل بعامل نخر الورم ألفا بوسط كامل. احتضن لمدة 24 ساعة أخرى. بعد 24 ساعة من إزالة عامل نخر الورم ألفا ، قم بشفط الوسائط وشطف الخلايا برفق باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة.

أضف مباشرة إلى كل بئر 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفحص الترسيب المناعي الإشعاعي المثلج الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز المضافة حديثا. قم بإزالة الخلايا من اللوحة باستخدام مكشطة الخلية. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ، وتجميع الآبار داخل مجموعات العلاج.

قم بثلج الخلايا عن طريق دوامة الأنابيب على ارتفاع لمدة ثلاث فترات على الأقل مدتها 15 ثانية. احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية مع التأرجح لمدة 15 دقيقة. دوامة الأنابيب مرة أخرى على ارتفاع.

جهاز الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية إلى الحطام الخلوي الحبيب. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر. قم بتخزين عينات البروتين الخلوي عند 80 درجة مئوية حتى التحليل بواسطة النشاف الغربي للبروتين محل الاهتمام.

بعد 72 ساعة من الثقافة ، يؤكد التحليل الكيميائي المناعي للسيتوكيراتين 7 ، الموضح باللون الأحمر ، في الأرومات الغاذية الأولية أن الخلايا خضعت للتزلم الخلوي الذي يتضح من وجود كتل خلايا متعددة النوى. علاوة على ذلك ، كشف التحليل الكيميائي المناعي للفيمنتين ، باللون الأحمر أيضا ، عن عدد قليل جدا من الخلايا الليفية الملوثة. يظهر التلوين النووي المضاد باللون الأزرق في كلتا الصورتين.

العلاج بعامل نخر الورم ألفا حتى 250 بيكوغرام لكل مليلتر تعبير روبيكون منظم. عند تركيزات ألفا TNF أكبر من 250 بيكوغرام لكل مليلتر ، انخفضت مستويات تعبير روبيكون مرة أخرى نحو خط الأساس وحتى أقل. وبالمثل ، يتم تنظيم روبيكون بشكل كبير في خزعات الأنسجة الزغابية المجمدة من المشيمة من حالات الحمل المفرطة مع الأجنة الإناث مقارنة بالضوابط الخالية من الدهون.

بمجرد إتقانها ، يمكن عزل الأرومات الغاذية عن الأنسجة الزغابية في غضون ست إلى سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إعداد المواد والكواشف في وقت مبكر حتى تتمكن من العمل بشكل متعمد وكفاءة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات أخرى ، مثل تلك التي تقيس الطاقة الحيوية الخلوية ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل هل يؤثر الالتهاب في البيئة داخل الرحم البدينة على القدرة الأيضية للأرومات الغاذية؟

بعد هذه الطريقة التطويرية مهدت الطريق لباحث المشيمة لتحديد تأثير بيئة الأم على وظيفة الأرومة الغاذية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الأرومات الغاذية من الأنسجة الزغابية لتجربة زراعة الخلايا الخاصة بك وكيفية تحديد تأثير التهاب TNF ألفا بوساطة في تنظيم المسارات الحرجة في الأرومات الغاذية. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية والخلايا المستنبتة و DMSO والأكريلاميد والكواشف المختزلة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واستخدام تقنية التعقيم أثناء تنفيذ هذا الإجراء.