تصنيع وتوصيف السقالات جريفيثسين تعديل الألياف للوقاية من الأمراض المنقولة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع وتعديل حمض البولي لاكتيك وحمض الجليكوليك المشترك والألياف المغزولة كهربائيا بكميات متفاوتة من البروتين المضاد للفيروسات جريفيثسين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توصيل المخدرات، مثل كيفية صياغة وتوصيف وسائل توصيل جديدة يمكن أن تمنع العدوى الفيروسية المنقولة جنسيا، مثل فيروس نقص المناعة البشرية-1. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن النشاط المضاد للفيروسات ل Griffithsin يتم تعظيمه باستخدام ألياف البوليمر المغزولة كهربائيا كسقالة ثابتة لجريفيثسين الموضعي للغاية على سطح الألياف.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الالتهابات الفيروسية والبكتيرية الأخرى ، بسبب إمكانات جريفيثسين الوقائية والعلاجية القوية ضد مجموعة متنوعة من أنواع العدوى. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للوقاية من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل الالتهابات الفيروسية أو البكتيرية الأخرى التي أظهر فيها جريفيثسين فعاليته. لبدء هذا الإجراء ، تزن 720 ملليغرام من 50/50 PLGA في 10 ملليلتر من التلألؤ.

باستخدام ماصة زجاجية مصلية ، أضف 3.0 مل من HFIP. غطي الخسيس بغشاء بلاستيكي. ثم قم بقياس وتسجيل الكتلة الدنيئة.

احتضان معلق البوليمر عند 37 درجة مئوية طوال الليل لضمان الذوبان الكامل للبوليمر. بعد ذلك ، قم بإعداد جهاز الغزل الكهربائي كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لشفط محلول البوليمر.

بعد ذلك ، قم بتوصيل طرف إبرة غير حاد عيار 18 بوصة مقاس 0.5 بوصة بالمحقنة. استغن عن المحلول الزائد لإزالة مساحة الرأس الفارغة في الإبرة. ضع المحقنة على مضخة حقنة ، واضبط معدل تدفق الجهاز على 2.0 مل في الساعة.

قم بتوصيل مصدر الطاقة بإبرة المحقنة. قم بتدوير محلول البوليمر بالكهرباء باستخدام جهد موجب 27 كيلو فولت. بعد أن يتم تدوير المحلول بالكامل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة.

اترك المغزل يدور لمدة 30 دقيقة إضافية ، لتبخر المذيب بالكامل. ثم قم بإيقاف تشغيل مجمع مغزل الدوار. باستخدام شفرة حلاقة ، قشر الألياف برفق من مغزل.

اجمع ألياف PLGA المغزولة كهربائيا في طبق بتري مسمى. ضع الطبق في مجفف طوال الليل لإزالة أي مذيب متبقي. للبدء ، قم بإعداد حلول PBS و MES كما هو موضح في بروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بإزالة EDC و NHS من الفريزر. دعهم يرتاحون ليوازنوا مع درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بوزن أربعة ملليغرامات من EDC في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

تزن ستة ملليغرامات من NHS في أنبوب طرد مركزي دقيق مختلف. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت MES إلى كل أنبوب. دوامة كلا الأنبوبين بقوة لضمان إذابة الكواشف بالكامل.

ثم ، قم بوزن 70 ملليغرام من الهيدروكسيلامين في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلترا. أضف 20 مل من PBS ، والدوامة. قم بتجميع كمية مناسبة من ألياف PLGA في أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملليلترا.

أضف ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت MES إلى الألياف. بعد ذلك ، أضف مليلتر واحد من كل من حلول EDC و NHS. استخدم غشاء بلاستيكي لإغلاق أنبوب الطرد المركزي المخروطي سعة 15 مل.

ضع الأنبوب على محور دوار لقلب المحلول برفق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 14 ميكرولترا من بيتا ميركابتو إيثانول لإخماد التفاعل. اقلب الأنبوب عدة مرات لضمان الخلط الكامل.

تخلص من المادة الطافية واشطف ألياف PLGA مرتين باستخدام 10 مل من PBS لكل غسلة. أضف كمية مناسبة من محلول مخزون GRFT إلى الأنبوب ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، أضف ما يكفي من PBS ليصل الحجم النهائي إلى ثمانية ملليلترات.

أغلق الأنبوب واقلبه لضمان الخلط الشامل. ختم الأنبوب بغشاء بلاستيكي. ضع الأنبوب على المدور لقلب المحلول برفق لمدة ساعتين.

بعد ذلك ، قم بإخماد التفاعل عن طريق إضافة ملليلترين من محلول الهيدروكسيلامين المحضر ، والدوامة لمدة 30 ثانية. تخلص من المادة الطافية. اشطف ألياف PLGA المعدلة على السطح مرتين ، باستخدام 10 مل من الماء النقي للغاية ، والدوامة لكل غسلة.

بعد ذلك ، انقل الألياف المغسولة إلى طبق بتري. ضع طبق بتري داخل المجفف حتى تجف الألياف تماما. ثم قم بتخزين طبق بتري على أربع درجات مئوية.

للبدء ، ضع ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. قم بتجميع ملليغرامين من الألياف في كل منهما. ثم أضف ملليلتر واحد من DMSO إلى كل أنبوب.

دوامة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لإذابة الألياف تماما. بعد ذلك ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر على الأقل 100 ضعف ، في المخزن المؤقت TE. يحفظ على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر ، حتى تحميل التوصيف مع إليزا.

قم بوزن ما بين 5 و 10 ملليغرام من الألياف المعدلة على السطح ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. سجل كتلة الألياف الموضوعة في كل أنبوب. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من محلول يحاكي البيئة الفسيولوجية لكل عينة.

احتضان العينات على شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة ما يقرب من مليلتر واحد من المحلول الذي يحتوي على GRFT الممتص وقم بنقله في أنابيب العنقود. يحفظ على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا لإجراء قياس البروتين.

ثم انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف ملليلترا واحدا من محلول المخزن المؤقت الجديد واحتضنه حتى النقطة الزمنية التالية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، يتم فحص شروط تصنيع ألياف PLGA المغزولة كهربائيا.

يشير تحليل SEM لألياف GRFT الفارغة و 0.05 نانومول و 0.5 نانومول و 5 نانومول إلى أن تعديل GRFT ليس له أي تأثير على مورفولوجيا الألياف. ينظر إلى جميع التكوينات على أنها ذات متوسط أقطار متشابهة ، حوالي 1.9 ميكرون ، مما يدل على اتساق عملية التصنيع المعدلة عبر دفعات. ثم يتم تحديد كمية GRFT المترافقة في الألياف المغزولة كهربائيا.

يحتوي تعديل 5 نانومول على 373 نانوغرام من GRFT ، بينما يحتوي التعديلان 0.5 و 0.05 على 165 و 42 على التوالي. يوضح هذا أن الألياف المترافقة بكثافة تعديل السطح النظرية العالية تؤدي إلى المزيد من GRFT المترافق مع الألياف. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة الارتباط العكسي في كفاءة الاقتران الناتجة.

بعد ذلك ، يتم تقييم كمية GRFT المترافقة تساهميا مع الألياف. خلال الساعات الأربع الأولى ، تم اكتشاف 113 نانوغراما و 25 نانوجراما و 10 نانوغراما من GRFT لكل ملليغرام من الألياف المغزولة كهربائيا في تركيزات التعديل النظري ل 5 نانومول و 0.5 نانومول و 0.05 نانومول ، على التوالي. بعد أربع ساعات ، يتم الكشف عن GRFT ضئيلة في الإخراج لجميع الصيغ الثلاثة.

تشير هذه البيانات إلى أن غالبية GRFT مرتبطة تساهميا بالألياف الكهربائية وأن GRFT الممتص على السطح يتم إطلاقه خلال الساعات الأربع الأولى. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أربعة أيام تقريبا. يتطلب الغزل الكهربائي لسقالة ألياف البوليمر يومين لتحضير محلول البوليمر والدوران الكهربائي.

في حين أن تعديل السطح والتجفيف اللاحق وتوصيف الألياف يتطلب يومين إضافيين على الأقل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على النسب المناسبة من الكواشف لضمان التعديل الأمثل. علاوة على ذلك ، من المهم أيضا التحقق من صحة معلمات الغزل الكهربائي لضمان مورفولوجيا الألياف المناسبة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال توصيل الأدوية لتصنيع ألياف مغزولة كهربائيا ، والتي لا تغلف العوامل المضادة للفيروسات داخل الألياف فحسب ، بل لديها القدرة على اقتران العوامل النشطة من خلال سطح الألياف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تدوير الألياف البوليمرية بالكهرباء ، وإجراء تعديل سطح الألياف باستخدام البروتين المضاد للفيروسات جريفيثسين ، وغريفيثسين النوعي المترافق مع الألياف. لا تنس أن العمل مع الكواشف مثل HFIP و beta-mercaptoethanol و EDC و NHS يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل التطبيق السليم لمعدات الوقاية الشخصية ، واستخدام أغطية الدخان الكيميائية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.