تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

الهدف العام من هذه التقنية هو مراقبة النشاط المشبكي للعرومات المشبكية المرئية عند التقاطع العصبي العضلي لليرقات ذبابة الفاكهة. نظام نموذجي ممتاز قابل للتعديل بسهولة للتلاعب الجيني. يمكن لهذه التقنية معالجة الأسئلة الرئيسية في علمك.

مثل كيفية تنظيم طفرات البروتينات المشبكية للانتقال المتشابك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة نشاط عدد محدود من مواقع الإطلاق وتسجيل تيارات الحركية السريعة ويمكن حلها بسهولة. لبدء التجربة:تحضير مجتذب القطب الكهربائي الدقيق.

استخدم مجهرا بتكبير 35X للتأكد من أن القطر الداخلي للقطب المسحوب يتراوح من سبعة إلى عشرة ميكرومترات. قم بتخزين الشعيرات الدموية في حاويات مغلقة بإحكام لمنع تراكم الغبار. بعد ذلك ، حريق الشعيرات الدموية المصقولة باستخدام فورة صغيرة.

تأكد من أن القطر الداخلي النهائي للقطب المصقول هو خمسة ميكرومترات. ثم انتقل إلى الانحناء. ثبت القطب الكهربائي في المناور وضع الطرف فوق الفتيل الذي لا يلمسه.

اضبط قيمة الحرارة على 60-70٪ من الحد الأقصى واضغط على دواسة الحدادة الدقيقة لمدة ثانية إلى ثانيتين لتسخين الفتيل. استخدم إبرة على شكل حرف L لسحب طرف القطب برفق وجعل الانحناء عند 90 درجة تقريبا. أمسك القطب الكهربائي فوق لهب الشعلة يدويا واجعل الانحناء الثاني من سبعة إلى عشرة ملليمترات من الانحناء الأول وبزاوية 120 درجة تقريبا.

تحضير محلول يشبه الهيموليمف أو HL3. احتفظ بالمحلول في المكرر واجعله طازجا كل أسبوع. قم بإعداد ماصات التحفيز بنفس طريقة تسجيل الماصات الزجاجية دون ثنيها.

بعد ذلك ، أدخل ماصة تحفيز في حامل قطب كهربائي صغير متصل بحقنة. لوحات تشريح مصنعة من أطباق بتري صغيرة مطلية بالإيبوكسي المطاط السيليكوني. ثم ، باستخدام الملقط ، اختر يرقات الطور الثالث المتجولة من قارورة.

قم بتثبيت اليرقات مع وضع الدبوس الأول في الخلف ودبوس آخر أمامي بالقرب من خطافات الفم. أضف حل HL3. على الجانب الظهري من اليرقات ، قم بعمل قطع باستخدام مقص زنبركي من الدبوس العلوي إلى الدبوس السفلي.

قم بتثبيت فيليه اليرقات مع وضع دبابيس إضافية على الجانبين الأيسر والأيمن من اليرقات. قم بإزالة الشجاعة والقصبة الهوائية باستخدام الملقط. قطع الأعصاب خارج الحبل العصبي البطني مباشرة باستخدام مقص زنبركي.

ضع طبق بتري مع التحضير على مرحلة المجهر. أدخل القطب المرجعي في الحمام. املأ قطب التسجيل بمحلول HL3.

تحت هدف 10X اغمر القطب الكهربائي في الحمام وضعه على العضلات ستة وسبعة من انفصال البطن من اثنين أو ثلاثة أو أربعة باستخدام مناور صغير. بعد ذلك ، قم بتبديل الهدف إلى 60X وركز على مجال الاهتمام باستخدام بصريات epi-florescence أو DIC. ضع طرف القطب الكهربائي أعلى العروة المشبكية ثم اضغط على القطب برفق شديد على العضلة لأن الضغط المفرط قد يتلف NMJ أو يؤدي إلى زيادة النشاط المشبكي التلقائي.

بعد ذلك ، قم بتشغيل مكبر الصوت ولوحة AD والكمبيوتر. ثم اختر وضع مشبك الجهد على مكبر الصوت. ابدأ برنامج الاستحواذ واختر الوضع الخالي من الفجوات وراقب مظهر MEJCs على شاشة الكمبيوتر.

تأكد من أن سعة MEJCs في حدود 0.2 إلى 0.7 نانو أمبير. باستخدام مناور دقيق تحت تحكم بصري ، ضع قطب التحفيز بالقرب من المحور العصبي ، مما يؤدي إلى تعصيب أجزاء البطن من اثنين إلى أربعة. قم بالضغط السلبي عن طريق سحب مكبس المحقنة المتصلة بحامل القطب الكهربائي بحيث يتم سحب المحور العصبي داخل القطب.

بعد ذلك ، قم بتشغيل المحفز. أدر المقبض الموجود على وحدة العزل لضبط تيار صفري ثم قم بزيادته برفق حتى تظهر EJCs أو حتى يتم الوصول إلى العتبة. إجراء التحفيز في نظام superthreshold.

مع زيادة تيار التحفيز مرتين تقريبا مقارنة بعتبة مراقبة EJCs. قم بقياس مقاومة الختم لقطب تسجيل الرقعة الكبيرة عن طريق تدوير مفتاح مقاومة القطب الكهربائي لمكبر الصوت لإغلاق موضع الاختبار. لاحظ قيمة مقاومة الختم بالجيجا أوم والتي سيتم عرضها في النافذة الحالية.

تتيح تسجيلات تصحيح الماكرو البؤري مراقبة النشاط المشبكي من العروات المشبكية المحددة. عندما يتم وضع القطب الكهربائي فوق عروة متشابكة ، يكون ل MEJCs المسجلة اتساع تتجاوز بشكل كبير مستوى الضوضاء ومراحل الارتفاع الحادة في نطاق أقل من المللي ثانية. عندما يتم تحريك قطب التسجيل بعيدا عن العروة المشبكية بعدة ميكرونات ، تنخفض سعة MEJCs المسجل تقريبا إلى مستوى الضوضاء.

بالكاد يمكن تمييز EJCs المسجلة عن الضوضاء ولها مراحل ارتفاع طويلة. تتيح التسجيلات البؤرية الكشف الدقيق عن MEJCs في المعقد وطفرة جنوم. بينما تظهر التسجيلات بين الخلايا من هذا المتحور أحداثا تتداخل ولا يمكن اكتشافها بشكل موثوق.

ضبط زوايا الرقاقة الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لتحديد موضع القطب. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحقق من تصوير أحداث الإطلاق الفردية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تكامل نشاط المناطق النشطة الفردية.