يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

الهدف العام من هذا النهج القائم على الفحص المجهري هو مراقبة العمليات المركزية أثناء نمو الخلايا البكتيرية. تمكننا هذه الطريقة من معالجة أسئلة مهمة في علم الجراثيم ، مثل كيفية تنسيق العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا البكتيرية وانقسامها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على استخدام الكواشف الفلورية لتصور أسطح الخلايا البكتيرية وهياكلها في الخلايا الحية.

هنا ، نستخدم هذه الطريقة لتقديم نظرة ثاقبة للعمليات الأساسية في Agrobacterium tumefaciens. ومع ذلك ، يمكن أيضا اعتماد هذه العملية على البكتيريا الأخرى لدراسة نموها أيضا. للبدء ، استخدم عصا خشبية معقمة أو طرف ماصة لتلقيح ثلاثة ملليلتر من ATGN Growth Medium ، بمستعمرة واحدة من النوع البري أو سلالة متحولة من A.Tumifaciens.

قم بزراعة المزرعة عند 28 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس OD600. بعد ذلك ، قم بتخفيف ثقافة الخلية إلى OD600 بحوالي 0.2 واستمر في نمو الخلايا إلى OD600 من 0.6.

قم بتوزيع مليلتر واحد من الثقافة الأسية في ثلاثة أنابيب ميكروفوج. وحبيبات الخلايا في جهاز طرد مركزي سطح المكتب عند 7،000 × جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق كل حبيبات خلية في مليلتر واحد من PBS ، ثم أضف إما ميكرولتر واحد من محلول مخزون DMSO Orange أو محلول مخزون DAPI.

امزج برفق عن طريق سحب العينة ، واحتضن الخلايا المعلقة في الظلام لمدة خمس دقائق. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 7, 000 × جم لمدة خمس دقائق, وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من PBS لإزالة الكاشف الزائد. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين أخريين ، وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من PBS أو متوسط.

للتصوير المتزامن بفاصل زمني ، اجمع عشرة ميكرولترات من الخلايا من كل علاج في أنبوب ميكرو فيوج جديد. لتحضير وسادات الاغاروز لتصوير الخلايا ، استخدم زلة غطاء كدليل ، وقم بقص فيلم مختبر بحجم 22 × 22 ملم مربع عن طريق تشغيل مشرط حول الحواف. قم بقص مربعا من وسط فيلم المختبر ، مع ترك حدود من ملليمترين إلى خمسة ملليمترات تقريبا لتكون بمثابة حشية لوسادة الاغاروز.

ثم تجاهل الفتحة المركزية. ضع حشية الفيلم على شريحة زجاجية ، وتنظيفها بمنظف خال من الأمونيا والكحول. واستخدم كتلة حرارية مضبوطة على 70 درجة مئوية أو لهب لتسخين الشريحة حتى يذوب الفيلم قليلا على الزجاج.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الاغاروز عن طريق خلط ما يقرب من 0.075 جرام من الاغاروز وخمسة ملليلتر من الوسط في قارورة صغيرة. سخني المحلول في الميكروويف مع دوامة دورية للخلط ، حتى يذوب الاغاروز ويصبح المحلول صافيا. احتفظ بمحلول الاغاروز عند 55-70 درجة مئوية واستخدمه لبناء وسادات أغالروز متعددة في غضون 48 ساعة.

ماصة وسط الاغاروز الدافئ في وسط الحشية. ثم ضع غطاء على الحشية لتوزيع الاغاروز بالتساوي. ضع الشريحة على سطح بارد ومستو لتتصلب لمدة دقيقتين تقريبا.

الآن ، حرك الغطاء بحذر من وسادة الاغاروز ، ثم اترك وسادة الاغاروز تجف في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة ، حتى يبدو سطح الوسادة جافا. يعد البناء السليم لوسادة الاغاروز أمرا بالغ الأهمية للحصول على صور عالية الجودة. لا تحاول التصوير على لوحة سيئة.

إذا جفت وسادة الاغاروز أو تموجت أو تمزقت ، فمن الأفضل ألا تكون كسولا وبدلا من ذلك ، اصنع وسادة جديدة. ثم ، باستخدام مشرط ، قم بإزالة شريط صغير من الاغاروز لإنشاء جيب هوائي حوالي اثنين في سبعة إلى عشرة ملليمترات. تميل خلايا A.Tumefacien إلى النمو بشكل أفضل بالقرب من الجيب الهوائي

بقعة 0.8 إلى 1 ميكرولتر من الخلايا على وسادة الاغاروز. ثم ضع غطاء برفق فوق الجزء العلوي من وسادة الاغاروز لتوزيع الخلايا عبر سطح الوسادة. للتصوير بفاصل زمني طويل الأمد ، استخدم Valap الذائب لإغلاق حواف زلة الغطاء.

تأكد من إغلاق جميع حواف وزوايا زلة الغطاء باستخدام Valap. يمكن أن يؤدي عدم القيام بذلك إلى الانجراف أثناء تصوير الفاصل الزمني للوحة الاغاروز. لإجراء الفحص المجهري اللامع ، ضع زيت الغمر على الهدف المطلوب وضع الشريحة المقلوبة في حامل الشريحة على المسرح.

استخدم مقابض التركيز البؤري لتركيز الخلايا. احصل على الصور في الطور ، أو DIC والمضان ، باستخدام مرشح التألق المطلوب للصور الفلورية. اختياريا ، احصل على مواضع x و y متعددة عن طريق الاختيار العشوائي لعشرة حقول من الخلايا على مقربة من الجيب الهوائي لوسادات الاغاروز.

قم بإعداد الحصول على التسلسل الزمني للصورة في الطور ، أو DIC ، في الفاصل الزمني المطلوب. كما هو موضح هنا ، تم تصوير الخلايا مباشرة من الثقافة بعد الغسيل بالطرد المركزي وبعد احتضان الخلايا بنسبة 0.1 في المائة DMSO ، أظهرت النتائج أن DMSO وحده لا يؤثر على مورفولوجيا الخلية. كل من البرتقال و DAPI المسمى الحمض النووي داخل خلايا A.Tumefaciens الحية.

في الخلايا المتأخرة قبل الانقسام ، لوحظ نوعان من النواة المتميزة مع تلطيخ برتقالي ، بينما يبدو وضع العلامات على الحمض النووي أكثر انتشارا مع تلطيخ DAPI. في تجربة الفاصل الزمني هذه مع نسبة متساوية من النوع البري A.Tumefaciens غير المسمى ، والمسمى DAPI ، والبرتقالي المسمى A.Tumefaciens ، نمت جميع الخلايا عند تصويرها باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور ، مما يشير إلى أن أيا من البقع لم تضعف نمو الخلايا. نمت الخلايا أيضا تحت تباين الطور في الفحص المجهري اللبي فلوري باستخدام مرشح TRITC.

ذلك ، عند تصويرها باستخدام مرشح DAPI ، توقفت الخلايا عن النمو في غضون ساعة. باتباع طرق مماثلة ، يمكن أيضا استخدام الكواشف الفلورية الأخرى لتصور جدار الخلية البكتيرية أو الأغشية. علاوة على ذلك ، يمكن دمج العديد من هذه الأصباغ الفلورية لتوفير صورة شاملة لسطح الخلية البكتيرية.

يعد تصور العمليات الأساسية في البكتيريا الحية أمرا مثيرا ، لأنه يفتح إمكانية دراسة هذه العمليات في الطفرات الشرطية أو البكتيريا غير النموذجية. هذا يسمح لنا بتعزيز دراساتنا للأنواع البكتيرية المتنوعة.