أساليب لتحليل آثار اليورانيوم الطبيعي في أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في آثار التعرض الطبيعي لليورانيوم على قابلية بقاء ناقضات العظم وتمايزها ووظيفتها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السمية البيئية حول تأثير التعرض لليورانيوم على فسيولوجيا العظام والتمثيل الغذائي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر أداة جديدة مثيرة للاهتمام لفحص منشئي اليورانيوم.

عندما تصل ثقافة الخلايا RAW 264.7 إلى 85 إلى 90٪ من التقاء ، استخدم مكشطة خلية لرفع الخلايا ميكانيكيا من قاع قارورة زراعة الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلترا. قم بضرب محلول الخلية عدة مرات لتفتيت الكتل وحساب معلق الخلية المفردة الناتج. قم بتخفيف الخلايا إلى تركيز واحد مرة 10 إلى أربعة خلايا لكل مليلتر في الحد الأدنى من الوسط الأساسي المعدل ألفا ، مع استكمال L-glutamine و 5٪ مصل بقري الجنين وإضافة مليلتر واحد من الخلايا لكل بئر إلى صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية.

معلمة مهمة لقابلية تكرار تمايز ناقضات العظم ومقايسة إعادة امتصاصها هي كثافة بذر الخلية. انتبه بشكل خاص لعد الخلايا وإعداد التعليق الخلوي وتجانسه قبل طلاء الخلايا. لتحضير محلول ملح المبولة ، بدءا من محلول مائي معقم من بيكربونات الصوديوم بنسبة 7.5٪ تم اختباره في زراعة الخلايا ، قم أولا بإعداد وتبريد 100 ملي مولار من بيكربونات الصوديوم في الماء على الثلج وإضافة حجم واحد من محلول أسيتات المبولة 100 مللي مولار ، قطرة قطرة ، إلى تسعة أحجام من محلول بيكربونات الثلج البارد مع رج لطيف.

اسمح للمحلول بالتوازن في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث ساعات ، قم بتخفيف الحجم المناسب من محلول المبولة ، قطرة قطرة ، في وسط تمايز يحتوي على 50 نانوغرام لكل مليلتر من RANKL حتى يتم تحقيق تركيز عمل المبولة المطلوب والسماح بثلاث ساعات أخرى من التوازن في درجة حرارة الغرفة. تعتبر خطوات الحضانة الطويلة بعد كل تخفيف لملح المبولة ضرورية لتثبيت مجمعات المبولة في المحاليل.

في نهاية فترة التوازن الثانية ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر برفق بمليلتر واحد من وسط المعالجة أو التحكم في المبولة حسب الاقتضاء وأعد الخلايا إلى الحاضنة. يجب أن تظهر ناقضات العظم متعددة النوى بين الأيام الثالثة والرابعة من الثقافة. لتقييم حجم وتشكل ناقضات العظم المتمايزة حديثا ، قم بتلطيخ الخلايا بفوسفاتيز حمض مقاوم للطرطرات ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتصوير السطح الكامل لكل بئر بدقة كافية لتمييز نوى الخلية.

عندما يتم تصوير جميع الآبار ، افتح صورة لبئر واحد باستخدام برنامج ImageJ مفتوح المصدر وتحقق من وحدات المقياس. ثم حدد المربع العام في النافذة المنبثقة لتطبيق وحدات المقياس الجديدة على جميع الصور اللاحقة. ضمن القائمة تحليل، حدد تعيين القياسات وحدد مربعي تسمية المنطقة والعرض.

قم بإلغاء تحديد جميع المربعات الأخرى. ضمن قائمة التحليل ، افتح الأدوات ثم مدير منطقة الاهتمام وحدد أداة التحديد المستطيلة في نافذة ImageJ الرئيسية. حدد مخططا لمنطقة اهتمام تبلغ حوالي 1,000 × 1,000 ميكرومتر وانقر فوق الزر إضافة لإضافة التحديد إلى إدارة منطقة الاهتمام.

ثم انقر فوق المزيد، حفظ لحفظ المنطقة. لإنشاء نسخة من إحدى المناطق الخمس المراد تحليلها، حدد منطقة الاهتمام في إدارة منطقة الاهتمام وانقر بزر الماوس الأيمن داخل المنطقة المحددة لتكرار المنطقة. حدد المربعات إظهار الكل والتسميات وحدد أداة تحديد المضلع لتحديد أحد ناقضات العظم يدويا في منطقة الاهتمام المكررة.

لإضافة هذا المخطط التفصيلي إلى إدارة منطقة الاهتمام، انقر فوق إضافة في نافذة إدارة منطقة الاهتمام. عند إضافة جميع ناقضات العظم ، حدد جميع الخطوط العريضة وانقر فوق قياس لقياس أسطحها. ثم انقل القياسات التي تظهر في نافذة النتائج إلى جدول بيانات.

لتقييم وظيفة ناقضات العظم المعالجة بالمبولة ، قبل يوم واحد من إضافة وسط التمايز ، قم بوضع خلايا RAW من 85 إلى 90٪ من ثقافة الخلايا المتقاربة إلى لوحة فحص العظم المكونة من 24 بئرا في وسط النمو ، كما هو موضح للتو. في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية برفق بوسط يحتوي على مبولة تمايزية واسمح للخلايا الخام بالتمايز إلى ناقضات العظم ، كما هو موضح للتو. في اليوم الخامس من تكوين العظم ، استبدل الوسط المحتوي على المبولة بمحلول مبيض بنسبة 10٪ لإزالة الخلايا من سطح محاكاة العظام.

بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الآبار مرتين بالماء منزوع الأيونات واتركها تجف في الهواء. بعد ذلك ، قم بتلطيخ أملاح الكالسيوم في المناطق غير الممتزة من كل بئر بمحلول ملح الصوديوم 1٪ Alizarin Red S. بعد 10 إلى 15 ثانية ، قم بإزالة محلول أليزارين واغسل الآبار برفق ثلاث إلى أربع مرات بالماء.

لتحويل صورة RGB للآبار الملطخة ب Alizarin إلى تدرج رمادي ، تنسيق 8 بت ، ضمن قائمة Image ، حدد Type و 8 بت. بعد ذلك ، باستخدام أداة الاختيار البيضاوية ، حدد سطح البئر بالكامل ليتم تحليله من أجل الارتشاف وحفظ المنطقة محل الاهتمام ، كما هو موضح للتو. لتسهيل تحديد الحد، حدد تحرير ومسح خارج لمسح جميع الميزات خارج منطقة الاهتمام المحددة.

قم بتكرار منطقة الاهتمام كما هو موضح للتو وحدد ضبط الحد ضمن قائمة صورة، واضبط شريط الشرائح لتحديد حد مناسب. يجب أن تكون جميع المناطق الممتصة أعلى من العتبة وتظهر بيضاء ، بينما يجب أن تكون جميع المناطق غير الممتصة أقل من العتبة وتظهر باللون الأحمر. لإنهاء تحديد الحد، انقر فوق تطبيق في نافذة الحد واحفظ الصورة الثنائية النهائية بالتنسيق المناسب الذي يثير اهتمامه.

لتحديد القياسات التي يجب إجراؤها داخل منطقة الاهتمام، ضمن القائمة تحليل، حدد تعيين القياسات وحدد مربعات المنطقة وكسر المنطقة والحد إلى الحد وقم بإلغاء تحديد جميع المربعات الأخرى. ثم للحصول على جزء من المنطقة الممتزة مباشرة داخل نافذة النتائج ، قم بعكس الصورة الثنائية المكررة عن طريق تحديد عكس ضمن قائمة تحرير والحرص على تحديد منطقة الاهتمام الرئيسية في الصورة الثنائية النهائية وقياس جزء المنطقة الممتصة. يمكن رؤية التغييرات في عدد وحجم ناقضات العظم المتمايزة حديثا استجابة لليورانيوم بسهولة في الصور المركبة لآبار كاملة ، وكذلك في الصور المكبرة لمناطق مختارة ذات أهمية.

يمكن تحليل حجم ناقضات العظم المزروعة في ظل ظروف استزراع مختلفة كما هو موضح للتو من خلال تحديد جميع ناقضات العظم داخل كل منطقة وقياس مساحة كل خلية محددة. للتحقيق في تأثير اليورانيوم على نشاط ارتشاف ناقضات العظم ، يتم طلاء خلايا RAW 264.7 وتمايزها على ألواح سطح العظم المقلدة. في نهاية الفحص ، تتم إزالة ناقضات العظم وتلطيخ المناطق غير الممتصة وتصويرها كما هو موضح.

ثم يتم تحويل الصور إلى تدرج رمادي 8 بت وعتبة لتسهيل حساب المناطق الممتسة. يمكن أيضا تطبيق هذا الإجراء على دراسة تأثير المعادن الثقيلة الأخرى على تكوين العظم.