الملحق الخامس ووسم بروبيديوم يوديد
يوفر التلوين باستخدام Annexin V و propidium iodide (PI) للباحثين طريقة لتحديد أنواع مختلفة من موت الخلايا - إما النخر أو موت الخلايا المبرمج. تعتمد هذ…
يعد وضع العلامات على الخلايا Annexin V و propidium iodide (PI) تقنية تستخدم لتحديد موت الخلايا ، والتمييز بين مساراته المختلفة: موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلايا المبرمج ، والنخر. تخضع الخلايا لتغيرات مورفولوجية مميزة اعتمادا على المسار. من خلال تحديد الظروف المحددة التي تقود الخلية إلى الخضوع لموت الخلايا المبرمج أو النخر ، يكتسب العلماء نظرة ثاقبة في علم وظائف الأعضاء الخلوي والفيزيولوجيا المرضية للمرض. تم إنشاء وضع العلامات على الملحق V و PI ، متبوعا بقياس التدفق الخلوي ، كواحدة من أكثر الطرق فعالية لتصنيف نوع موت الخلايا.
اليوم ، سنصف كيف يساعد هذا الاختبار في تحديد مسارات موت الخلايا ، وكيفية تنفيذ هذه التقنية ، وبعض أمثلة التجارب المثيرة التي تستخدم هذه الطريقة للإجابة على أسئلة مهمة في مجال بيولوجيا الخلية.
أولا ، دعنا نلقي نظرة على المبادئ الكامنة وراء تلطيخ الملحق V و PI.
كما ذكرنا سابقا ، تظهر الخلايا المبرمج سمات مورفولوجية مميزة. وتشمل هذه انكماش الخلايا ، وفقاع الغشاء ، والتجزئة النووية ، وظهور أجسام موت الخلايا المبرمج. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تحريض موت الخلايا المبرمج - أي في المرحلة المبكرة من موت الخلايا المبرمج - تظهر بعض التغييرات المميزة على الغشاء. يحتوي غشاء الخلية الطبيعي على جميع بقايا الفوسفاتيديل سيرين أو PS على النشرة الداخلية. ومع ذلك ، في الخلايا المبرمجة المبكرة ، يتم نقل بعض بقايا PS هذه إلى السطح الخارجي - ولكن كيف؟
لفهم ذلك ، دعنا نعود خطوة إلى الوراء. أثناء موت الخلايا المبرمج ، من المعروف أن الكاسباز العصاري الخلوي يتم تنشيطه. تنشط هذه الإنزيمات بدورها إنزيما مرتبطا بالغشاء يسمى scramblase. Scramblase "يخلط" غشاء الخلية عن طريق نقل بقايا PS من الجانب السيتوبلازمي إلى السطح الخارجي. في المقابل ، أثناء النخر ، تظل بقايا PS في مكانها ، لكن الغشاء نفسه يتمزق. تستفيد ملصقات Annexin V و PI من هذه الاختلافات في التغيرات الغشائية لنوعي موت الخلايا.
الملحق الخامس المترافق مع صبغة الفلورسنت ، مثل الفلورسينات إيزوثيوسيانات - المعروف باسم FITC - هو غشاء غير منفذ ، رابط طبيعي ل PS ، وبالتالي يحدد بسهولة الخلايا المبرمجة المبكرة عن طريق الارتباط ب PS الخارجي. ومع ذلك ، بعد تمزق الغشاء ، والذي يحدث أثناء النخر وأيضا خلال المراحل اللاحقة من موت الخلايا المبرمج ، يمكن أن يرتبط الملح أيضا ب PS على الوجه الداخلي وينتج عنه إيجابيات خاطئة.
لتجنب ذلك ، يستخدم العلماء PI. جزيء صبغة ربط الحمض النووي هذا غير منفذ للغشاء مرة أخرى ، ولا يمكن أن يدخل الخلية إلا عندما يتمزق الغشاء. لذلك ، إذا كانت الخلية ملطخة فقط ، فهي موت الخلايا المبرمج المبكر ، في حين أن الخلية الملطخة ب PI و Annexin يمكن أن تكون إما نخرية أو متغيرة الخلايا المبرمج المتأخرة.
الآن بعد أن تعلمت المبادئ الأساسية وراء هذا الاختبار ، دعنا ننتقل إلى إجراءات تلطيخ وتحليل موت الخلايا.
أولا ، يتم حصاد الخلايا وطردها بسرعة منخفضة لمنع أي اضطراب مورفولوجي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل الفسيولوجي مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، والمعروف أيضا باسم PBS. بعد خطوة أخرى من الطرد المركزي ، يتم تعليق الخلايا في الملحق الخامس المخزن المؤقت الملزم المحتوي على الكالسيوم ، وهو أمر ضروري للملحق المرتبط ب PS. ثم يضاف الملحق V المقترن ب FITC إلى المحلول ، الذي يتم احتضانه في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بالملحق والارتباط PS. في الخطوة التالية ، تتم إضافة PI مباشرة إلى محلول خلية تلطيخ الملحق ويتم تحضينها في الظلام. بعد الحضانة ، يتم غسل الخلايا في PBS عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل المؤقت ، والاحتفاظ بها على الجليد. الآن هم جاهزون للتحليل.
يتم تحليل نشاط التألق للخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وهي تقنية تعتمد على الليزر تلتقط بيانات التألق من الخلايا المفردة المعلقة في تيار من السوائل. بعد معايرة التألق باستخدام خلايا ملطخة بشكل منفصل بكل صبغة ، يتم الحصول على بيانات من الخلايا الملطخة المزدوجة. تستخدم إشارات التألق من مجموعة الخلايا لإنشاء مخطط حيث يتم رسم شدة FITC المرتبطة بالملحق على المحور X اللوغاريتمي ، و PI على المحور اللوغاريتمي Y. سوف تتجمع الخلايا الملحقة-FITC الإيجابية و PI السلبية على الجانب الأيمن السفلي من المؤامرة ، والتي تمثل الخلايا المبرمج المبكرة ، وستحدث الخلايا الموجبة المزدوجة ل annexin-FITC و PI في الجزء العلوي الأيمن ، والتي تمثل الخلايا المبرمجة أو الخلايا المبرمجة المتأخرة. الخلايا التي تظل غير ملوثة أو ملطخة بشكل غير ملحوظ لكل من الملحق و PI هي خلايا حية.
نظرا لأنك تعرف الآن سبب اعتماد علماء الأحياء الخلوية على هذه التقنية لدراسة موت الخلايا ، فلماذا لا نراجع بعض تطبيقاتها.
باستخدام هذا الإجراء ، يمكن للعلماء متابعة البروتينات داخل الخلايا المتورطة في موت الخلايا المبرمج. في هذا الفيديو ، حلل الباحثون تأثير سيسبلاتين ، وهو دواء مضاد للسرطان ، على خلايا الكلى الطبيعية لمعرفة ما إذا كان يحفز موت الخلايا المبرمج. تم تحويل مجموعة واحدة من الخلايا للإفراط في التعبير عن شكل نشط من بروتين إنزيم كيناز C ، أو PKC ، وتم تحويل المجموعة الأخرى بشكل غير وظيفي - PKC سلبي مهيمن. خضعت الخلايا التي تعبر عن PKC وعولجت بالسيسبلاتين لموت الخلايا المبرمج بمرور الوقت ، لكن الخلايا التي تعبر عن PKC السلبية غير النشطة كانت مقاومة لموت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى أن الإنزيم هو لاعب رئيسي في مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيسبلاتين.
يستخدم الباحثون أيضا هذه البقع لاختبار إمكانات السمية للخلايا التائية المحددة. يمكن للخلايا التائية السامة للخلايا التعرف على بروتينات غشائية معينة على الخلية المستهدفة ، وتحفز موتها عند الارتباط بها. هنا ، قام الباحثون باحتضان الخلايا التائية الخاصة بالمستضد مع الخلايا السرطانية المستهدفة والملحق V ، ثم لاحظوا تحريض موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية عن طريق مشاركة الخلايا التائية. كشفت بيانات قياس التدفق الخلوي عن النسبة المئوية لموت الخلايا المستهدفة في وجود وعدم وجود الخلايا التائية السامة للخلايا.
أخيرا ، يستخدم العلماء هذه الطريقة لتقييم بقاء الخلية بعد توصيل الجينات. في هذه الحالة ، أراد الباحثون تقييم بقاء الخلية بعد النواة - وهي طريقة تستخدم مزيجا من المواد الكيميائية ومجالا كهربائيا مطبقا لإنشاء مسام عابرة في الأغشية الخلوية والنووية ، وبالتالي تسهيل توصيل الجينات. باستخدام الملحق الخامس بالإضافة إلى صبغة تسمى 7-أمينواكتينومايسين D أو 7-AAD ، والتي ، على غرار PI يرتبط بالحمض النووي ، أظهروا أن النواة تسبب في انخفاض موت الخلايا إما عن طريق موت الخلايا المبرمج أو النخر.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على الملصقات الملحق V و PI. في هذا الفيديو ، ناقشنا بإيجاز السمات المميزة للخلايا المبرمج والخلايا النخرية ، واستعرضنا المبادئ الكامنة وراء هذه الطريقة ، وشاهدنا إجراء معمما لهذه التقنية شائعة الاستخدام ، وقمنا بمعاينة بعض التطبيقات. نظرا لأهمية فهم كيفية موت الخلايا المختلفة في ظل ظروف مختلفة ، فإن وضع العلامات على الملحق V و PI بمثابة أداة مهمة لعلماء الأحياء الخلوية المهتمين بهذه الظاهرة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يعد وضع العلامات على الخلايا Annexin V و propidium iodide (PI) تقنية تستخدم لتحديد موت الخلايا ، والتمييز بين مساراته المختلفة: موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلايا المبرمج ، والنخر. تخضع الخلايا لتغيرات مورفولوجية مميزة اعتمادا على المسار. من خلال تحديد الظروف المحددة التي تقود الخلية إلى الخضوع لموت الخلايا المبرمج أو النخر ، يكتسب العلماء نظرة ثاقبة في علم وظائف الأعضاء الخلوي والفيزيولوجيا المرضية للمرض. تم إنشاء وضع العلامات على الملحق V و PI ، متبوعا بقياس التدفق الخلوي ، كواحدة من أكثر الطرق فعالية لتصنيف نوع موت الخلايا.
اليوم ، سنصف كيف يساعد هذا الاختبار في تحديد مسارات موت الخلايا ، وكيفية تنفيذ هذه التقنية ، وبعض أمثلة التجارب المثيرة التي تستخدم هذه الطريقة للإجابة على أسئلة مهمة في مجال بيولوجيا الخلية.
أولا ، دعنا نلقي نظرة على المبادئ الكامنة وراء تلطيخ الملحق V و PI.
كما ذكرنا سابقا ، تظهر الخلايا المبرمج سمات مورفولوجية مميزة. وتشمل هذه انكماش الخلايا ، وفقاع الغشاء ، والتجزئة النووية ، وظهور أجسام موت الخلايا المبرمج. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تحريض موت الخلايا المبرمج - أي في المرحلة المبكرة من موت الخلايا المبرمج - تظهر بعض التغييرات المميزة على الغشاء. يحتوي غشاء الخلية الطبيعي على جميع بقايا الفوسفاتيديل سيرين أو PS على النشرة الداخلية. ومع ذلك ، في الخلايا المبرمجة المبكرة ، يتم نقل بعض بقايا PS هذه إلى السطح الخارجي - ولكن كيف؟
لفهم ذلك ، دعنا نعود خطوة إلى الوراء. أثناء موت الخلايا المبرمج ، من المعروف أن الكاسباز العصاري الخلوي يتم تنشيطه. تنشط هذه الإنزيمات بدورها إنزيما مرتبطا بالغشاء يسمى scramblase. Scramblase "يخلط" غشاء الخلية عن طريق نقل بقايا PS من الجانب السيتوبلازمي إلى السطح الخارجي. في المقابل ، أثناء النخر ، تظل بقايا PS في مكانها ، لكن الغشاء نفسه يتمزق. تستفيد ملصقات Annexin V و PI من هذه الاختلافات في التغيرات الغشائية لنوعي موت الخلايا.
الملحق الخامس المترافق مع صبغة الفلورسنت ، مثل الفلورسينات إيزوثيوسيانات - المعروف باسم FITC - هو غشاء غير منفذ ، رابط طبيعي ل PS ، وبالتالي يحدد بسهولة الخلايا المبرمجة المبكرة عن طريق الارتباط ب PS الخارجي. ومع ذلك ، بعد تمزق الغشاء ، والذي يحدث أثناء النخر وأيضا خلال المراحل اللاحقة من موت الخلايا المبرمج ، يمكن أن يرتبط الملح أيضا ب PS على الوجه الداخلي وينتج عنه إيجابيات خاطئة.
لتجنب ذلك ، يستخدم العلماء PI. جزيء صبغة ربط الحمض النووي هذا غير منفذ للغشاء مرة أخرى ، ولا يمكن أن يدخل الخلية إلا عندما يتمزق الغشاء. لذلك ، إذا كانت الخلية ملطخة فقط ، فهي موت الخلايا المبرمج المبكر ، في حين أن الخلية الملطخة ب PI و Annexin يمكن أن تكون إما نخرية أو متغيرة الخلايا المبرمج المتأخرة.
الآن بعد أن تعلمت المبادئ الأساسية وراء هذا الاختبار ، دعنا ننتقل إلى إجراءات تلطيخ وتحليل موت الخلايا.
أولا ، يتم حصاد الخلايا وطردها بسرعة منخفضة لمنع أي اضطراب مورفولوجي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل الفسيولوجي مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، والمعروف أيضا باسم PBS. بعد خطوة أخرى من الطرد المركزي ، يتم تعليق الخلايا في الملحق الخامس المخزن المؤقت الملزم المحتوي على الكالسيوم ، وهو أمر ضروري للملحق المرتبط ب PS. ثم يضاف الملحق V المقترن ب FITC إلى المحلول ، الذي يتم احتضانه في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بالملحق والارتباط PS. في الخطوة التالية ، تتم إضافة PI مباشرة إلى محلول خلية تلطيخ الملحق ويتم تحضينها في الظلام. بعد الحضانة ، يتم غسل الخلايا في PBS عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل المؤقت ، والاحتفاظ بها على الجليد. الآن هم جاهزون للتحليل.
يتم تحليل نشاط التألق للخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وهي تقنية تعتمد على الليزر تلتقط بيانات التألق من الخلايا المفردة المعلقة في تيار من السوائل. بعد معايرة التألق باستخدام خلايا ملطخة بشكل منفصل بكل صبغة ، يتم الحصول على بيانات من الخلايا الملطخة المزدوجة. تستخدم إشارات التألق من مجموعة الخلايا لإنشاء مخطط حيث يتم رسم شدة FITC المرتبطة بالملحق على المحور X اللوغاريتمي ، و PI على المحور اللوغاريتمي Y. سوف تتجمع الخلايا الملحقة-FITC الإيجابية و PI السلبية على الجانب الأيمن السفلي من المؤامرة ، والتي تمثل الخلايا المبرمج المبكرة ، وستحدث الخلايا الموجبة المزدوجة ل annexin-FITC و PI في الجزء العلوي الأيمن ، والتي تمثل الخلايا المبرمجة أو الخلايا المبرمجة المتأخرة. الخلايا التي تظل غير ملوثة أو ملطخة بشكل غير ملحوظ لكل من الملحق و PI هي خلايا حية.
نظرا لأنك تعرف الآن سبب اعتماد علماء الأحياء الخلوية على هذه التقنية لدراسة موت الخلايا ، فلماذا لا نراجع بعض تطبيقاتها.
باستخدام هذا الإجراء ، يمكن للعلماء متابعة البروتينات داخل الخلايا المتورطة في موت الخلايا المبرمج. في هذا الفيديو ، حلل الباحثون تأثير سيسبلاتين ، وهو دواء مضاد للسرطان ، على خلايا الكلى الطبيعية لمعرفة ما إذا كان يحفز موت الخلايا المبرمج. تم تحويل مجموعة واحدة من الخلايا للإفراط في التعبير عن شكل نشط من بروتين إنزيم كيناز C ، أو PKC ، وتم تحويل المجموعة الأخرى بشكل غير وظيفي - PKC سلبي مهيمن. خضعت الخلايا التي تعبر عن PKC وعولجت بالسيسبلاتين لموت الخلايا المبرمج بمرور الوقت ، لكن الخلايا التي تعبر عن PKC السلبية غير النشطة كانت مقاومة لموت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى أن الإنزيم هو لاعب رئيسي في مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيسبلاتين.
يستخدم الباحثون أيضا هذه البقع لاختبار إمكانات السمية للخلايا التائية المحددة. يمكن للخلايا التائية السامة للخلايا التعرف على بروتينات غشائية معينة على الخلية المستهدفة ، وتحفز موتها عند الارتباط بها. هنا ، قام الباحثون باحتضان الخلايا التائية الخاصة بالمستضد مع الخلايا السرطانية المستهدفة والملحق V ، ثم لاحظوا تحريض موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية عن طريق مشاركة الخلايا التائية. كشفت بيانات قياس التدفق الخلوي عن النسبة المئوية لموت الخلايا المستهدفة في وجود وعدم وجود الخلايا التائية السامة للخلايا.
أخيرا ، يستخدم العلماء هذه الطريقة لتقييم بقاء الخلية بعد توصيل الجينات. في هذه الحالة ، أراد الباحثون تقييم بقاء الخلية بعد النواة - وهي طريقة تستخدم مزيجا من المواد الكيميائية ومجالا كهربائيا مطبقا لإنشاء مسام عابرة في الأغشية الخلوية والنووية ، وبالتالي تسهيل توصيل الجينات. باستخدام الملحق الخامس بالإضافة إلى صبغة تسمى 7-أمينواكتينومايسين D أو 7-AAD ، والتي ، على غرار PI يرتبط بالحمض النووي ، أظهروا أن النواة تسبب في انخفاض موت الخلايا إما عن طريق موت الخلايا المبرمج أو النخر.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على الملصقات الملحق V و PI. في هذا الفيديو ، ناقشنا بإيجاز السمات المميزة للخلايا المبرمج والخلايا النخرية ، واستعرضنا المبادئ الكامنة وراء هذه الطريقة ، وشاهدنا إجراء معمما لهذه التقنية شائعة الاستخدام ، وقمنا بمعاينة بعض التطبيقات. نظرا لأهمية فهم كيفية موت الخلايا المختلفة في ظل ظروف مختلفة ، فإن وضع العلامات على الملحق V و PI بمثابة أداة مهمة لعلماء الأحياء الخلوية المهتمين بهذه الظاهرة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does phosphatidylserine translocation distinguish apoptotic cells from necrotic cells?
During apoptosis, cytosolic caspases activate scramblase, an enzyme that translocates phosphatidylserine (PS) residues from the inner cell membrane to the outer surface. In necrosis, PS remains internal but the membrane ruptures. Annexin V binds externalized PS in early apoptotic cells, while propidium iodide enters only when membranes rupture, allowing researchers to differentiate between these death pathways.
Q2: Why is propidium iodide used alongside annexin V in cell death assays?
Propidium iodide (PI) is a membrane-impermeable DNA-binding dye that enters cells only when membranes rupture. Since annexin V alone cannot distinguish early apoptosis from late apoptosis or necrosis, PI provides critical differentiation. Cells positive for annexin V but negative for PI indicate early apoptosis, while double-positive cells represent late apoptotic or necrotic cells.
Q3: What are the key steps in preparing cells for annexin V and propidium iodide staining?
Cells are harvested and centrifuged at low speed, then resuspended in phosphate-buffered saline (PBS). After centrifugation, cells are resuspended in annexin V binding buffer containing calcium, which is necessary for annexin binding to phosphatidylserine. Annexin V conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) is added and incubated in the dark, followed by propidium iodide addition and another dark incubation.
Q4: How does flow cytometry interpret annexin V and propidium iodide staining patterns?
Flow cytometry plots annexin-FITC intensity on the logarithmic X-axis and PI on the Y-axis. Cells positive for annexin-FITC but negative for PI cluster in the lower right quadrant, representing early apoptotic cells. Double-positive cells appear in the upper right, indicating late apoptotic or necrotic cells. Unstained or insignificantly stained cells in the lower left represent live cells.
Q5: How have researchers used annexin V and PI labeling to study protein kinase C in cisplatin-induced apoptosis?
Researchers compared kidney cells overexpressing active protein kinase C (PKC) with cells expressing inactive dominant-negative PKC. When treated with cisplatin, cells with active PKC underwent apoptosis over time, while dominant-negative PKC cells resisted apoptosis. This demonstrated that PKC is a key player in the cisplatin-induced apoptosis pathway, revealing important mechanisms of an introduction to cell death.
Q6: What do annexin V and PI staining reveal about cytotoxic T cell function?
Researchers incubate antigen-specific cytotoxic T cells with target tumor cells in the presence of annexin V and PI. Flow cytometry data reveals the percentage of target cell death induced by T cell engagement. This method demonstrates how cytotoxic T cells recognize specific membrane proteins on target cells and induce apoptosis upon binding.
Q7: How is annexin V and PI staining used to assess cell viability after nucleofection?
Nucleofection uses chemicals and electric fields to create transient pores in cell membranes for gene delivery. Researchers use annexin V plus 7-aminoactinomycin D (7-AAD), a DNA-binding dye similar to PI, to evaluate cell survival post-nucleofection. This staining approach quantifies cell death by apoptosis or necrosis, demonstrating nucleofection's impact on cell viability.