الملحق الخامس ووسم بروبيديوم يوديد

يعد وضع العلامات على الخلايا Annexin V و propidium iodide (PI) تقنية تستخدم لتحديد موت الخلايا ، والتمييز بين مساراته المختلفة: موت الخلايا المبرمج ، أو موت الخلايا المبرمج ، والنخر. تخضع الخلايا لتغيرات مورفولوجية مميزة اعتمادا على المسار. من خلال تحديد الظروف المحددة التي تقود الخلية إلى الخضوع لموت الخلايا المبرمج أو النخر ، يكتسب العلماء نظرة ثاقبة في علم وظائف الأعضاء الخلوي والفيزيولوجيا المرضية للمرض. تم إنشاء وضع العلامات على الملحق V و PI ، متبوعا بقياس التدفق الخلوي ، كواحدة من أكثر الطرق فعالية لتصنيف نوع موت الخلايا.

اليوم ، سنصف كيف يساعد هذا الاختبار في تحديد مسارات موت الخلايا ، وكيفية تنفيذ هذه التقنية ، وبعض أمثلة التجارب المثيرة التي تستخدم هذه الطريقة للإجابة على أسئلة مهمة في مجال بيولوجيا الخلية.

أولا ، دعنا نلقي نظرة على المبادئ الكامنة وراء تلطيخ الملحق V و PI.

كما ذكرنا سابقا ، تظهر الخلايا المبرمج سمات مورفولوجية مميزة. وتشمل هذه انكماش الخلايا ، وفقاع الغشاء ، والتجزئة النووية ، وظهور أجسام موت الخلايا المبرمج. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تحريض موت الخلايا المبرمج - أي في المرحلة المبكرة من موت الخلايا المبرمج - تظهر بعض التغييرات المميزة على الغشاء. يحتوي غشاء الخلية الطبيعي على جميع بقايا الفوسفاتيديل سيرين أو PS على النشرة الداخلية. ومع ذلك ، في الخلايا المبرمجة المبكرة ، يتم نقل بعض بقايا PS هذه إلى السطح الخارجي - ولكن كيف؟

لفهم ذلك ، دعنا نعود خطوة إلى الوراء. أثناء موت الخلايا المبرمج ، من المعروف أن الكاسباز العصاري الخلوي يتم تنشيطه. تنشط هذه الإنزيمات بدورها إنزيما مرتبطا بالغشاء يسمى scramblase. Scramblase "يخلط" غشاء الخلية عن طريق نقل بقايا PS من الجانب السيتوبلازمي إلى السطح الخارجي. في المقابل ، أثناء النخر ، تظل بقايا PS في مكانها ، لكن الغشاء نفسه يتمزق. تستفيد ملصقات Annexin V و PI من هذه الاختلافات في التغيرات الغشائية لنوعي موت الخلايا.

الملحق الخامس المترافق مع صبغة الفلورسنت ، مثل الفلورسينات إيزوثيوسيانات - المعروف باسم FITC - هو غشاء غير منفذ ، رابط طبيعي ل PS ، وبالتالي يحدد بسهولة الخلايا المبرمجة المبكرة عن طريق الارتباط ب PS الخارجي. ومع ذلك ، بعد تمزق الغشاء ، والذي يحدث أثناء النخر وأيضا خلال المراحل اللاحقة من موت الخلايا المبرمج ، يمكن أن يرتبط الملح أيضا ب PS على الوجه الداخلي وينتج عنه إيجابيات خاطئة.

لتجنب ذلك ، يستخدم العلماء PI. جزيء صبغة ربط الحمض النووي هذا غير منفذ للغشاء مرة أخرى ، ولا يمكن أن يدخل الخلية إلا عندما يتمزق الغشاء. لذلك ، إذا كانت الخلية ملطخة فقط ، فهي موت الخلايا المبرمج المبكر ، في حين أن الخلية الملطخة ب PI و Annexin يمكن أن تكون إما نخرية أو متغيرة الخلايا المبرمج المتأخرة.

الآن بعد أن تعلمت المبادئ الأساسية وراء هذا الاختبار ، دعنا ننتقل إلى إجراءات تلطيخ وتحليل موت الخلايا.

أولا ، يتم حصاد الخلايا وطردها بسرعة منخفضة لمنع أي اضطراب مورفولوجي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل الفسيولوجي مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، والمعروف أيضا باسم PBS. بعد خطوة أخرى من الطرد المركزي ، يتم تعليق الخلايا في الملحق الخامس المخزن المؤقت الملزم المحتوي على الكالسيوم ، وهو أمر ضروري للملحق المرتبط ب PS. ثم يضاف الملحق V المقترن ب FITC إلى المحلول ، الذي يتم احتضانه في درجة حرارة الغرفة في الظلام للسماح بالملحق والارتباط PS. في الخطوة التالية ، تتم إضافة PI مباشرة إلى محلول خلية تلطيخ الملحق ويتم تحضينها في الظلام. بعد الحضانة ، يتم غسل الخلايا في PBS عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليقها في مخزن الغسيل المؤقت ، والاحتفاظ بها على الجليد. الآن هم جاهزون للتحليل.

يتم تحليل نشاط التألق للخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وهي تقنية تعتمد على الليزر تلتقط بيانات التألق من الخلايا المفردة المعلقة في تيار من السوائل. بعد معايرة التألق باستخدام خلايا ملطخة بشكل منفصل بكل صبغة ، يتم الحصول على بيانات من الخلايا الملطخة المزدوجة. تستخدم إشارات التألق من مجموعة الخلايا لإنشاء مخطط حيث يتم رسم شدة FITC المرتبطة بالملحق على المحور X اللوغاريتمي ، و PI على المحور اللوغاريتمي Y. سوف تتجمع الخلايا الملحقة-FITC الإيجابية و PI السلبية على الجانب الأيمن السفلي من المؤامرة ، والتي تمثل الخلايا المبرمج المبكرة ، وستحدث الخلايا الموجبة المزدوجة ل annexin-FITC و PI في الجزء العلوي الأيمن ، والتي تمثل الخلايا المبرمجة أو الخلايا المبرمجة المتأخرة. الخلايا التي تظل غير ملوثة أو ملطخة بشكل غير ملحوظ لكل من الملحق و PI هي خلايا حية.

نظرا لأنك تعرف الآن سبب اعتماد علماء الأحياء الخلوية على هذه التقنية لدراسة موت الخلايا ، فلماذا لا نراجع بعض تطبيقاتها.

باستخدام هذا الإجراء ، يمكن للعلماء متابعة البروتينات داخل الخلايا المتورطة في موت الخلايا المبرمج. في هذا الفيديو ، حلل الباحثون تأثير سيسبلاتين ، وهو دواء مضاد للسرطان ، على خلايا الكلى الطبيعية لمعرفة ما إذا كان يحفز موت الخلايا المبرمج. تم تحويل مجموعة واحدة من الخلايا للإفراط في التعبير عن شكل نشط من بروتين إنزيم كيناز C ، أو PKC ، وتم تحويل المجموعة الأخرى بشكل غير وظيفي - PKC سلبي مهيمن. خضعت الخلايا التي تعبر عن PKC وعولجت بالسيسبلاتين لموت الخلايا المبرمج بمرور الوقت ، لكن الخلايا التي تعبر عن PKC السلبية غير النشطة كانت مقاومة لموت الخلايا المبرمج ، مما يشير إلى أن الإنزيم هو لاعب رئيسي في مسار موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيسبلاتين.

يستخدم الباحثون أيضا هذه البقع لاختبار إمكانات السمية للخلايا التائية المحددة. يمكن للخلايا التائية السامة للخلايا التعرف على بروتينات غشائية معينة على الخلية المستهدفة ، وتحفز موتها عند الارتباط بها. هنا ، قام الباحثون باحتضان الخلايا التائية الخاصة بالمستضد مع الخلايا السرطانية المستهدفة والملحق V ، ثم لاحظوا تحريض موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية عن طريق مشاركة الخلايا التائية. كشفت بيانات قياس التدفق الخلوي عن النسبة المئوية لموت الخلايا المستهدفة في وجود وعدم وجود الخلايا التائية السامة للخلايا.

أخيرا ، يستخدم العلماء هذه الطريقة لتقييم بقاء الخلية بعد توصيل الجينات. في هذه الحالة ، أراد الباحثون تقييم بقاء الخلية بعد النواة - وهي طريقة تستخدم مزيجا من المواد الكيميائية ومجالا كهربائيا مطبقا لإنشاء مسام عابرة في الأغشية الخلوية والنووية ، وبالتالي تسهيل توصيل الجينات. باستخدام الملحق الخامس بالإضافة إلى صبغة تسمى 7-أمينواكتينومايسين D أو 7-AAD ، والتي ، على غرار PI يرتبط بالحمض النووي ، أظهروا أن النواة تسبب في انخفاض موت الخلايا إما عن طريق موت الخلايا المبرمج أو النخر.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على الملصقات الملحق V و PI. في هذا الفيديو ، ناقشنا بإيجاز السمات المميزة للخلايا المبرمج والخلايا النخرية ، واستعرضنا المبادئ الكامنة وراء هذه الطريقة ، وشاهدنا إجراء معمما لهذه التقنية شائعة الاستخدام ، وقمنا بمعاينة بعض التطبيقات. نظرا لأهمية فهم كيفية موت الخلايا المختلفة في ظل ظروف مختلفة ، فإن وضع العلامات على الملحق V و PI بمثابة أداة مهمة لعلماء الأحياء الخلوية المهتمين بهذه الظاهرة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!