فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن
سبتمبر 12, 2017
ويحلل هذا البروتوكول خطوة بخطوة المورفولوجية جيوتاكسيس السلبية سلوك استخدام نظام اسطوانة متعددة يستضيف مئات ذباب ويزامن أعمالهم بمحرك كهربائي. عند المزامنة، هو جزيئي السلوك جيوتاكسيس السلبية يطير، المسجلة رقمياً، وتم تحليلها باستخدام البرمجيات رفليديتيكشن المصممة ذاتيا.
الهدف العام من هذا الفحص الآلي المتكرر والتكراري لـ negative geotaxis هو تحليل عجز التسلق لدى ذبابة الفاكهة البالغة المرتبط بالتحلل العصبي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة أساسية في مجال العلوم العصبية مثل آلية العجز الحركي المرتبط بالتحلل العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل نشاط تسلق الذبابة بطريقة آلية واحترافية عالية.
تمتد آثار هذه التقنية إلى العلاج وتشخيص التحلل العصبي، لأن الأمراض التنكسية العصبية ترتبط بشكل متكرر بفقدان تدريجي للقدرة على الحركة وتقلص العمر وتطور التحلل العصبي المعتمد على العمر. كانت لدينا الفكرة لأول مرة لهذه الطريقة. أردنا قياس نشاط حركي ذبابة الفاكهة البالغة بطريقة أكثر دقة.
لتنفيذ جمع الذباب، ابدأ بالاحتفاظ بالذباب على طعام الذباب القياسي عند 25 درجة مئوية، 70٪ رطوبة و12 ساعة من الضوء، 12 ساعة من الظلام على مدار اليوم. اجمع عذارى UAS-Dicer2 DDC-GAL4 تحت تخدير ثاني أكسيد الكربون. عبر العذارى إلى ذكور البالغين البالغين من العمر يومين يحملون الأنماط الجينية التالية، مع نسبة ذكر/أنثى من واحد إلى اثنين.
اجمع الذكور والإناث حديثي الولادة بشكل منفصل في ثلاثة قوارير لكل مجموعة في كل تجربة، وضع 10 ذباب في كل برميل ذباب عادي مع طعام قياسي. ثم اضبط القوارير على 25 درجة مئوية. لتنفيذ فحص RING الآلي، قم بنقل 10 ذباب من الجنسين لكل نمط جيني إلى كل برميل.
ثم قم بتأمين البرميل بمسمار. قم بتحليل الذباب الضابط والذباب الذي يحمل أنماطًا جينية مختلفة معًا لكل مجموعة من التجارب. قم بتشغيل الكاميرا الرقمية الموضوعة أمام الجهاز، وبمجرد تحميل الذباب وجاهزيته، ابدأ التسجيل.
يجب وضع الكاميرا أفقيًا والكاميرا على مسافة مناسبة من جهاز RING لالتقاط المواقع في مواقع دقيقة نسبيًا لجميع الذباب. بعد السماح للذباب بالاستقرار في القوارير لمدة دقيقة، قم بتشغيل وحدة التحكم في الخطوات التي تتحكم في محرك الخطوات. يقوم هذا بتشغيل المحرك الكهربائي الصغير للتحكم في الرافعة المرفقة، بحيث يرتفع بشكل متتالي ويدق الجهاز أربع مرات في ثانيتين.
بعد دق الجهاز، لاحظ أن الذباب يبدأ في الصعود على الجدار. مع استمرار التسجيل، كرر المزامنة كما هو موضح، في فترات 60 ثانية لمدة ثلاث إلى خمس محاولات متتالية. كرر التجربة لمدة خمس، و15، و25 و35 يومًا من عمر الذباب.
قم بإجراء ثلاثة تجارب مستقلة على الأقل لكل مجموعة لكل تجربة، مع ما لا يقل عن 30 ذبابًا مجمّعًا أو ثلاثة قوارير. لتحليل البيانات، قم باستيراد الفيديو المسجل إلى الكمبيوتر. لكل محاولة، قم بالتقاط لقطة من الفيديو بعد ست ثوانٍ من الدق.
في برنامج كشف R-fly، استخدم قائمة الملفات لاستيراد صورة اللقطة. بعد ذلك، باستخدام أيقونة خط الأساس على شريط الأدوات، قم بضبط الخطوط الأساسية العلوية والسفلية للبرميل بدقة ثم استخدم المؤشر لتحديد الخطوط الأساسية العلوية والسفلية على الصورة. داخل شريط الإعدادات، في حقل Flies in Rect، أدخل عدد الذباب لكل برميل، وفي حقل Tube Height، أدخل طول البرميل.
يتم اكتشاف مواقع الذباب الفردية وتمييزها بنقاط على الشاشة لكل برميل. لاحظ أنه في جدول على اللوحة اليمنى، يحدد البرنامج تلقائيًا مسافة التسلق لكل ذباب ويعرض القيم المتوسطة من 10 ذباب في كل برميل. قدم البيانات كمتوسط زائد أو ناقص SEM.
احسب قيم P للأهمية باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنة المتعددة من Bonferroni. أظهرت تحليلات الذباب المعينة باسم Dicer2 باستخدام فحص RING الآلي المقدم في هذا الفيديو انخفاضًا يعتمد على العمر في مسافة التسلق في فترة زمنية مدتها ست ثوانٍ لكل من الذباب الذكور والإناث، مما يشير إلى أن التعبير aux في الخلايا العصبية الدوبامينية أو DA هو أمر بالغ الأهمية لنشاط الحركة للذباب. لا يبدو أن قدرة التسلق تتأثر بالتعبير الزائد عن auxGFP في الخلايا العصبية DA والتعبير المشترك عن auxR وauxGFP في الخلايا العصبية DA التي تم إنقاذها من ظاهرة RNAi.
بمجرد إتقانها، يمكن القيام بذلك في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. أصبح هذا التطوير الآن طريقة للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف التحلل العصبي في ذبابة الفاكهة الشائعة. لا تنسَ أن العمل مع جهاز RING الكهربائي يمكن أن يكون خطيرًا للغاية ويجب تثبيت كل تأكيد بإحكام والتحقق منه بعناية قبل إجراء هذه العملية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول طريقة مؤتمتة لتحليل سلوك الانتحاء الأرضي السالب في ذبابة Drosophila، مع التركيز على قصور التسلق لدى البالغين المرتبط بالتنكس العصبي. تستخدم هذه التقنية نظاماً متعدد الأسطوانات لمزامنة وتسجيل حركات الذباب، مما يوفر رؤى حول القصور الحركي.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علوم الأعصاب
- التحليل السلوكي
- التنكس العصبي
خلفية علمية
- تُستخدم ذبابة الفاكهة Drosophila ككائن نموذجي لدراسة الأمراض التنكسية العصبية.
- يُعد سلوك الانتحاء الأرضي السلبي مقياساً للقدرة الحركية في الذباب.
- غالباً ما يؤدي التنكس العصبي إلى فقدان تدريجي للحركة وتقصير في مدى الحياة.
- تعمل الأنظمة المؤتمتة على تعزيز دقة المقايسات السلوكية.
الغرض من الدراسة
- لتحليل عجز التسلق في ذبابة Drosophila المرتبط بالتنكس العصبي.
- لاستكشاف الآليات الكامنة وراء قصور الحركة.
- لتحسين دقة قياس النشاط الحركي للذباب.
الطرق المستخدمة
- نظام آلي متعدد الأسطوانات لتحريك الذباب بشكل متزامن.
- تسجيل رقمي لسلوك الانتحاء الأرضي السالب.
- التحليل باستخدام برنامج RflyDetection المصمم داخلياً.
- مقايسة تكرارية سريعة لجمع البيانات بإنتاجية عالية.
النتائج الرئيسية
- تزامن ناجح لحركات الذباب من أجل تحليل دقيق.
- تحديد قصور في القدرة على التسلق مرتبط بالتنكس العصبي.
- أثبت التحليل الآلي كفاءته وموثوقيته.
- آثار محتملة على علاج وتشخيص الأمراض التنكسية العصبية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا المقايسة الآلية طريقة قوية لدراسة السلوك الحركي في Drosophila.
- قد تساهم الرؤى المكتسبة في تطوير نهج علاجية للتنكس العصبي.
- تعزز هذه التقنية من فهم العلاقة بين الحركة وحالات التنكس العصبي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يتيح هذا المقايسة الآلية عالية الإنتاجية التحديد الكمي السريع للعجز الحركي في نماذج Drosophila المصابة بالتنكس العصبي، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة من خلال توفير قراءات سلوكية موضوعية وقابلة للتكرار. وتعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في الفرز قبل السريري عن طريق السماح بالتحليل المتزامن لمئات الذباب عبر أنماط جينية ومجموعات عمرية متعددة، مما يسهل التقييم الفعال للمركبات أو المعدلات الجينية. ويساعد دمجها في سير عمل الاكتشاف في تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف التنكسية العصبية من خلال التنميط الظاهري القياسي والقابل للتوسع.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس عجز التسلق المرتبط بالعمر والناجم عن التحلل العصبي في النماذج الجينية.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال القياس عالي الإنتاجية للنشاط الحركي كدليل على السلامة العصبية.
- القيمة التنبؤية: تولد بيانات سلوكية كمية تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال تحديد الأنماط الجينية التي تعاني من خلل حركي ملحوظ.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر مقاييس موحدة وقابلة للتكرار للرحيل الأرضي السلبي، وهي مناسبة للتحقق من صحة الاختبارات في حملات الفحص التي تركز على التنكس العصبي.
- القيمة التشغيلية: تتيح الفحص السريع للمعدلات الجينية أو الدوائية عبر التصوير بالفيديو الآلي والتحليل باستخدام برنامج RflyDetection.
- القابلية للتوسع: تعالج بيانات مئات الذباب في كل دورة تشغيل، مما يزيد من الإنتاجية ويقلل التباين مقارنة بالاختبارات اليدوية.
الأبحاث الانتقالية والسريرية الأولية
- الأهمية الترجمية: يوفر نظاماً مرتبطاً بالمرض لتقييم الأنماط الظاهرية الحركية التي توازي العجوزات الحركية السريرية في الاضطرابات التنكسية العصبية.
- الاستمرارية قبل السريرية: يدعم التقييم الطولي عبر أعمار الذباب (5، 15، 25، 35 يوماً) لنمذجة التنكس العصبي التدريجي.
- الحد من المخاطر الميكانيكية: يتيح تقييم تجارب الإنقاذ الجيني (مثل التعبير المشترك لـ auxR/auxGFP) للتحقق من خصوصية الهدف ومشاركة المسار.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يتناسب هذا المقايسة مع سلسلة عمليات الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر نقطة نهاية سلوكية كمية تربط بين التعديل الوراثي والنتيجة المظهرية في نماذج التنكس العصبي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط التعبير الجيني (على سبيل المثال، aux في العصبونات الدوبامينية) بالوظيفة الحركية عبر القياس المتكرر للانتحاء الأرضي السلبي.
- الفحص: توفر مخرجات قياسية جاهزة للمقايسة (مسافة التسلق خلال 6 seconds) تتيح إجراء مقارنة موثوقة عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- التحليلات: تُنتج بيانات المتوسط ± SEM بدقة إحصائية (one-way ANOVA، وتصحيح Bonferroni) لدعم المقارنات بين المجموعات واختبارات الدلالة.
- الأبحاث traslational: تربط القراءات السلوكية بآليات التنكس العصبي، مما يدعم التقييم المظهري المتوافق مع المؤشرات الحيوية في النماذج قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام للفحص السلوكي الطولي عبر أنماط جينية وأعمار ومجموعات علاجية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض الآلي عبر التنميط الظاهري السلوكي القابل للقياس وعالي الدقة.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار والتوحيد القياسي من خلال المزامنة الآلية، والتسجيل الرقمي، والتحليل المعتمد على البرمجيات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين التقييم السريع للعجز الحركي عبر أحجام عينات كبيرة.
- تأثير المحفظة: تسهل ترتيب أولويات الأهداف المعدلة حسب المخاطر استناداً إلى بيانات قوية للتطور الظاهري المعتمد على العمر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع ذباب Drosophila، وصيانة التهجين الوراثي، وإعداد اختبارات السلوك.
- يعتمد على أجهزة متخصصة تشمل جهاز RING الآلي، ووحدة التحكم في الخطوات، وكاميرا رقمية، وإضاءة متوافقة.
- يستلزم بنية تحتية حوسبية لاستيراد الفيديو، واستخراج اللقطات الثابتة، وتشغيل برنامج RflyDetection.
- يتضمن توحيد الظروف البيئية (25°C، ورطوبة 70%، ودورة ضوء/ظلام مدتها 12h) وبروتوكولات تحضير القوارير.
- يشمل اعتبارات السلامة نظراً لوجود مكونات كهربائية؛ ويجب تأمين الجهاز والتحقق منه قبل التشغيل.
