What is DNA fragmentation and how does it occur during apoptosis?

DNA fragmentation is a hallmark of apoptosis where chromosomal DNA is cleaved into fragments with nicked ends. Caspases, enzymes in the cytosol, activate caspase-activated DNase (CAD) by removing its inhibitor. Activated CAD travels to the nucleus and cleaves chromosomal DNA, creating fragments that accumulate and signal cell death.

How does the TUNEL assay detect apoptotic cells?

The TUNEL assay fluorescently labels nicked DNA ends in apoptotic cells. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) catalyzes the attachment of fluorescently labeled deoxyuridine triphosphate (dUTP) nucleotides to free 3' hydroxyl groups on fragmented DNA. This creates TUNEL positive cells visible under fluorescence microscopy.

What are the main steps in performing a TUNEL assay on tissue sections?

The TUNEL assay protocol includes tissue fixation using 4% paraformaldehyde, cryosectioning into 10 µm slices, permeabilization with proteinase K, adding TdT enzyme and labeled dUTPs, incubating for 1-3 hours at 37°C, stopping the reaction with stop buffer, and visualizing with fluorescence microscopy.

Why is tissue permeabilization necessary before adding TUNEL reagents?

Permeabilization allows TUNEL reagents, particularly the TdT enzyme, to penetrate the cell nucleus and access fragmented DNA. Proteinase K treatment for 5-15 minutes at 37°C creates pores in cell membranes, enabling the enzyme to reach its substrate inside the nucleus.

How can researchers use TUNEL staining to study apoptosis in disease?

Researchers apply TUNEL staining to examine apoptosis in various disease contexts. For example, scientists use it to assess tumor responsiveness to drugs by treating human tumor samples with experimental compounds and measuring increased apoptosis. TUNEL staining quantifies cell death by counting the percentage of TUNEL positive cells in tissue sections.

What role do caspases play in initiating DNA fragmentation?

Caspases are proteolytic enzymes present in the cytosol that execute apoptosis by cleaving cellular proteins. They activate caspase-activated DNase (CAD) by detaching it from its inhibitor ICAD. Once activated, CAD enters the nucleus and cleaves chromosomal DNA, producing the fragmented DNA that TUNEL assays detect.

What does TUNEL positive staining indicate about cells in a tissue sample?

TUNEL positive cells are undergoing apoptosis and contain fragmented DNA with nicked ends labeled by fluorescent dUTP. These cells appear fluorescent under microscopy and indicate programmed cell death. Counting TUNEL positive cells provides a quantitative measure of apoptosis occurring in a tissue section.

اختبار TUNEL

0 مشاهدة08:12 دقيقة

يستخدم اختبار TUNEL بشكل شائع للكشف عن الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج ، وهو شكل من أشكال موت الخلايا المبرمج. موت الخلايا المبرمج هو عملية بيولوجية مهمة أثناء التطور ، وللحفاظ على توازن الأنسجة. يسمح تلطيخ TUNEL بتصور الخلايا المبرمج وتقديرها الكمي. يساعد هذا العلماء على اختبار فعالية العلاجات الجديدة للاضطرابات التي يتم فيها تثبيط موت الخلايا المبرمج ، كما هو الحال في السرطان ، أو تعزيزه ، كما هو الحال في التنكس العصبي.

سيشرح هذا الفيديو كيف يمكن استخدام مقايسة TUNEL لتسمية الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج ، وهو بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة في أقسام الأنسجة ، وكيف يطبق الباحثون هذه التقنية لفهم آليات موت الخلايا.

قبل الخوض في بروتوكول اختبار TUNEL ، دعنا نناقش المبادئ الكامنة وراء هذه التقنية.

واحدة من الخصائص المميزة العديدة لموت الخلايا المبرمج هي تجزئة الحمض النووي. كيف يحدث تجزئة الحمض النووي؟ يتم إجراء موت الخلايا المبرمج بواسطة إنزيمات تسمى الكاسباسات الموجودة في العصارة الخلوية. دورها الأساسي هو شق البروتينات من أجل تفكيك الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تنشط الكاسباسات إنزيما يسمى DNase المنشط بالكاسباز ، أو CAD ، عن طريق فصله عن مثبطه - ICAD. CAD المنشط هو نوكلياز داخلي ينتقل إلى النواة ويشق الحمض النووي الكروموسومي.

يؤدي انقسام الحمض النووي في النهاية إلى تراكم شظايا الحمض النووي ذات النهايات المكسورة ، ويصنف مقايسة TUNEL هذه الأطراف المقطعة من الحمض النووي المجزأ ، مما يسمح للعلماء باكتشاف موت الخلايا المبرمج. لكن كيف يحدث هذا؟ لذلك عليك أن تفهم تفاعل TUNEL. TUNEL تعني وضع العلامات الطرفية dUTP بوساطة dUTP. الكواشف الرئيسية TUNEL هما ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي ، أو TdT ، وديوكسيويريد ثلاثي الفوسفات ، أو dUTP ، والتي يمكن تصنيفها بالفلورسنت لسهولة الكشف.

لفهم تفاعل TUNEL ، دعنا نعود إلى الخلايا المتبرمجة التي تحتوي على شظايا الحمض النووي. تحتوي هذه الأجزاء المقطعة على مجموعات هيدروكسيل 3 بوصات مجانية. بمجرد إضافة كواشف TUNEL إلى عينة تحتوي على خلايا موت الخلايا المبرمج ، ترتبط dUTPs المسماة بالفلورسنت بمجموعات الهيدروكسيل 3 بمساعدة إنزيم المحفز TdT. تسمى الخلايا الملطخة باستخدام هذا الإجراء بالخلايا الموجبة TUNEL ، والتي يمكن بعد ذلك تصورها باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

الآن بعد أن فهمت المبادئ والمفاهيم الأساسية وراء اختبار TUNEL ، دعنا نحدد بروتوكولا عاما لأداء هذه التقنية في أقسام الأنسجة. تشمل الخطوات الرئيسية لمقايسة TUNEL إصلاح الأنسجة ذات الأهمية ، ونفاذية الأنسجة ، وإضافة كواشف TUNEL ، وإيقاف تفاعل TUNEL ، وأخيرا التحليل.

أولا ، يجب إصلاح الأنسجة ذات الأهمية من أجل الحفاظ على الهياكل البيولوجية. يعمل التثبيت عن طريق ربط البروتينات داخل الخلايا. بالنسبة لمقايسة TUNEL ، يمكن إصلاح الأنسجة عن طريق إضافتها إلى محلول يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 4-24 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، قم بتقطيع الأنسجة بالتبريد إلى شرائح رفيعة من 10 ميكرومتر أو أقل.

الخطوة التالية هي النفاذية ، والتي تسمح للكواشف مثل إنزيم TdT باختراق نواة الخلية. يمكن إجراء نفاذية أقسام الأنسجة عن طريق إضافة الأنسجة إلى محلول البروتيناز K لمدة 5-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اشطف أقسام الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات على شاكر مداري لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد النفاذية ، تتم إضافة إنزيم TdT و dUTPs المصنفة فلورسنت إلى أقسام الأنسجة ، جنبا إلى جنب مع مخزن مؤقت لوضع العلامات يحتوي على الكوبالت الذي يعمل كعامل مساعد لتفاعل TUNEL. معا ، يتم تحضين خليط تفاعل TUNEL وقسم الأنسجة لمدة 1-3 ساعات عند 37 درجة مئوية ، ويتم حمايتها من الضوء لمنع التألق من التلاشي.

بعد الحضانة ، تتم إضافة المخزن المؤقت للتوقف إلى قسم الأنسجة لإيقاف تفاعل TUNEL ، وبعد حضانة قصيرة يتم غسل الأقسام بمحلول ملحي مخزن للفوسفات. أخيرا ، يتم تصور أقسام الأنسجة الملطخة باستخدام dUTP الموسومة بالفلورسنت باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، ويتم تقييمها لتوطين الخلايا الإيجابية ل TUNEL داخل نسيج معين. يمكن للمرء أن يحدد موت الخلايا ببساطة عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل TUNEL في قسم معين من الأنسجة.

الآن بعد أن رأيت كيفية إجراء اختبار TUNEL للكشف عن الخلايا موت الخلايا المبرمج ، دعنا نناقش كيف يمكن استخدام هذا الاختبار لمعالجة الأسئلة التي يطرحها علماء الأحياء الخلوية.

يحدث موت الخلايا كجزء طبيعي من التطور لنحت الأنسجة والهياكل ، والقضاء على الخلايا غير الضرورية. لذلك ، يدرس العلماء المهتمون بهذه الظاهرة تأثير التعرض قبل الولادة لمواد مختلفة على موت الخلايا المبرمج أثناء التطور. هنا ، كان العلماء مهتمين بفحص تأثير التعرض للكحول قبل الولادة على نمو الدماغ. كشفت نتائج تلطيخ TUNEL الذي تم إجراؤه على أدمغة الجنين عن زيادة موت الخلايا المبرمج في الأنسجة التي تعرضت للكحول قبل الولادة ، مقارنة بحيوانات التحكم.

يستخدم العلماء أيضا اختبار TUNEL للتحقيق في موت الخلايا المبرمج استجابة للعدوى البكتيرية. في هذه التجربة ، طور العلماء نموذجا للالتهاب الرئوي عن طريق حقن الفئران ب Pseudomonas aeruginos ، والذي يحفز التهاب الرئة. بعد ذلك ، تمت إزالة أنسجة الرئة وتم إجراء تلطيخ TUNEL لفحص موت الخلايا المبرمج استجابة للعدوى البكتيرية. تشير النتائج إلى أن موت الخلايا المبرمج زاد في الفئران المعرضة للبكتيريا ، مقارنة بحيوانات التحكم.

أخيرا ، يمكن استخدام تلطيخ TUNEL في عينات الورم البشرية ، من أجل تحديد استجابة الورم للأدوية. في هذا المثال ، تم حصاد عينات الورم من المرضى البشريين وزرعها خارج الجسم الحي. بعد ذلك ، تم علاجهم بأدوية ما قبل السريرية وتقييمهم للاستجابة باستخدام مقايسة TUNEL. تظهر البيانات التي تم الحصول عليها أن العلاج بدواء يثبط بروتين الصدمة الحرارية 90 يزيد بشكل كبير من موت الخلايا المبرمج في أنسجة الورم.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول استخدام اختبار TUNEL للكشف عن الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج. استعرض هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء تلطيخ TUNEL ، وبروتوكول خطوة بخطوة لإجراء اختبار TUNEL على أقسام الأنسجة. استعرضنا أيضا كيف يمكن تطبيق هذه الطريقة لفهم موت الخلايا المبرمج أثناء التطور والمرض. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

واحدة من السمات المميزة لموت الخلايا المبرمج هي تجزئة الحمض النووي النووي بواسطة النوويات. يتم تنشيط هذه الإنزيمات بواسطة الكاسباسات ، وهي عائلة البرو…