عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل البكتيريا السليمة والمخصبة التي تحتوي على البلعمة. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة مثل التغيرات في نضوج البلعمة ومعالجة المستضد عندما تغزو الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض الخلايا المضيفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تنتج بكتيريا عالية الجودة تحتوي على البلعمة باستخدام خطوات بسيطة ودون الحاجة إلى معدات متخصصة.

سيجد الأفراد الجدد على الطريقة أنها ودودة من الناحية الفنية مقارنة بالمنهجيات غير المنهجية. خطرت لنا فكرة تطوير هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا ندرس الآليات التي تختطف بها مسببات الأمراض داخل الخلايا البلعمة لصالحها. ستظهر هذا الإجراء ساراي جوتيريز ، وهي طالبة ما بعد الدكتوراه من مختبري.

لبدء ثقافة السالمونيلا التيفيموريوم ، استخدم حلقة بكتيرية لتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في 5 ملليلتر من مرق ضخ القلب في الدماغ. ثم احتضان التعليق في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل أثناء الرج. انقل ملليلترا واحدا من هذا المعلق البكتيري إلى 19 مل مرق BHI في قارورة مخروطية في اليوم التالي.

احتضن مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز. عندما يصل OD600 إلى واحد ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة وانقل المزرعة إلى أنبوب سعة 50 مل. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 5400 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 10 ملليلتر PBS معقم. بعد تكرار الطرد المركزي مرة واحدة ، أعد تعليق الحبيبات في 4.9 مل من PBS. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول ربط البيوتين المحضر حديثا بالتعليق البكتيري.

بعد تقسيم هذا التعليق إلى خمسة أنابيب سعة 1.5 مليلتر ، احتضن في كتلة حرارية في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز مستمر عند 350 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. بعد الطرد المركزي للأنابيب عند 15،000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق ، تخلص من المادة الطافية. بعد خطوتين أخريين للطرد المركزي والإزالة الكاملة لمحلول ربط البيوتين ، أعد تعليق هذه البكتيريا المشفرة بالبيوتين في مليلتر واحد معقم PBS في أنبوب واحد سعة 1.5 ملليلتر.

انقل 100 ميكرولتر من محلول الخرز المغناطيسي المترافق بالستربتافيدين إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وضعه في رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق. بعد إزالة المذيب من الأنبوب ، قم بإزالة الأنبوب من الرف المغناطيسي. ثم أعد تعليق الخرزات التي بقيت في الأنبوب مع ملليلتر واحد من المعلق البكتيري المشفر بالبيوتين.

احتضان الأنبوب على كتلة حرارية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع الرج عند 350 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق. استخدم ماصة لإزالة البكتيريا التي لم تلتصق بالحائط ونقلها إلى أنبوب جديد يسمى بكتيريا غير مشفرة.

يحتوي الأنبوب ذو الخرز المغناطيسي الملتصق بالجدار على بكتيريا مرمزة من البيوتين ستربتافيدين. قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على بكتيريا Biotin Streptavidin المشفرة من الرف المغناطيسي وأعد تعليقه في PBS معقم مليلتر واحد. بعد أن يكون الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق ، قم بإزالة PBS.

أخيرا ، أعد تعليق البكتيريا المغسولة بالبيوتين Streptavidin في 500 ميكرولتر من PBS المعقم وقم بتسمية الأنبوب على أنه بكتيريا مشفرة. في اليوم السابق للإصابة ، تم تمايز اللوحة BMDMs تماما في طبق طوله ستة سنتيمترات في RPMIs مكمل بعشرة بالمائة FBS. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للتعليق البكتيري المشفر عند 15،000 × جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في وسط RPMI المكمل بعشرة بالمائة FBS. قم بإزالة الوسط من BMDMs وأضف خمسة ملليلتر من المعلق البكتيري المشفر في وسط RPMI من أجل إصابة الخلايا. لمزامنة البلعمة ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

ثم لبدء البلعمة ، احتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة بالمائة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط من الأطباق واغسل الخلايا ثلاث مرات في RPMI لإزالة البكتيريا غير الداخلية. لقتل أي بكتيريا غير بلعمية عند عشرة ملليلتر من RPMI تحتوي على عشرة بالمائة FBS في 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الجنتاميسين.

أخيرا ، قم باحتضان BMDMs المصابة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة خمسة بالمائة حتى النقطة الزمنية المطلوبة. أولا ، قم بإعداد حجم المخزن المؤقت لعزل البلعمة المطلوب A عن طريق إضافة DTT و Cytochalasin B قبل الاستخدام مباشرة ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. قم بإزالة الوسط من الخلايا المصابة في النقطة الزمنية المطلوبة واغسل الخلايا باستخدام PBS معقم تم تسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف 750 ميكرولترا من Phagosome Isolation Buffer A إلى الطبق واحتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة. تذكر أن تهز اللوحة من حين لآخر. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من Phagosome Isolation Buffer B ثم قم بهز الألواح للتأكد من أن المخزن المؤقت يغطي السطح بالكامل.

اكشط الخلايا برفق باستخدام شرطي مطاطي لإزالة الخلايا من الطبق ونقلها إلى أنبوب 1.5 مليلتر مبرد مسبقا. ثم استخدم حقنة مليلتر واحد لتمرير تعليق الخلية من خلال إبرة قياس 26 على الأقل 15 مرة. بعد ذلك ، ضع تعليق الخلية على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق.

الجسيمات المرتبطة بالخرز المغناطيسي هي البلعمة التي تحتوي على S.Typhimurium مشفر. ثم انقل المعلق الذي يحتوي على بقية المكونات الخلوية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر يسمى العصارة الخلوية. قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على البلعمة المعزولة من الرف وأعد تعليقه في مليلتر واحد PBS معقم.

ضع الأنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي لمدة خمس دقائق ثم قم بإزالة PBS. بعد تكرار هذا الغسيل باستخدام PBS مرة واحدة ، قم بإزالة PBS وأخيرا ، أعد تعليق S.Typhimurium الذي يحتوي على البلعمة في المخزن المؤقت المطلوب. لتقييم فعالية S.Typhimurium Biotinylation عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، أصيبت BMDMs ب mCherry S.Typhimurium المسمى بالبيوتين.

بعد التثبيت والحضانة باستخدام Cy5-Streptavidin ، تم تأكيد نجاح البيوتينيل بواسطة إشارة الفلورسنت Cy5-Streptavidin. لوحظت هذه الإشارة حصريا في mCherry S.Typhimurium البيوتينيل بينما لم تكن هناك إشارة في mCherry S.Typhimurium غير الحيوي. أظهر تحليل الكتلة المناعية للبلعمات المعزولة إثراء كبير ل mCherry الذي يعبر عن S.Typhimurium في البلعمة مقارنة بالجزء العصاري

أظهر تحليل الكتلة المناعية باستخدام علامات الجسيم الداخلي والليزوزوم في البلعمة المعزولة إثراء العلامات المختبرة في البلعمة المعزولة بعد أربع ساعات من الإصابة مقارنة ب 30 دقيقة بعد الإصابة. عندما تم تطبيق هذا البروتوكول على المكورات العنقودية الذهبية ، تم عرض البيوتينيل الناجح ل GFP الذي يعبر عن المكورات العنقودية الذهبية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي ساعة ونصف اعتمادا على وقت الحضانة الذي يختاره المحقق للعدوى.

لضمان نجاح عزل البكتيريا المحتوية على البلعمة ، يرجى التأكد من أن المخازن المؤقتة تحتوي على التركيزات المشار إليها وأن الصفائح مهتزة لضمان التغطية المتجانسة للخلايا. أيضا ، كن لطيفا عند كشط الخلايا وعند تمرير تعليق الخلية عبر الإبرة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل البروتينات أو التمثيل الغذائي باستخدام البلعمات المعزولة لدراسة التغيير الناجم عن مسببات الأمراض تحت العوامل المسببة للأمراض المعنية.