طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على خطوط الخلايا القاتلة الطبيعية أو التائية من مرضى CAEBV والتي لها أهمية كبيرة في البحث عن هذا المرض القاتل. تساعد هذه الطريقة في الحصول على خطوط الخلايا القاتلة الطبيعية أو التائية للبحث في آلية CAEBV ، مثل دراسة VBV الخام على تكاثر الخلايا ، ومثبطات الفحص التي تتداخل مع تكاثر الخلايا NK / T. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وفعالة للغاية ولا تتطلب سوى كمية صغيرة من الدم المحيطي وجرعة منخفضة من الحديد لإنشاء خطوط الخلايا القاتلة الطبيعية أو التائية من مرضى CAEBV.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة ، لأن بقاء الخلية في أول أسبوعين من الثقافة غير مؤكد وستوضح لك هذه الطريقة كيفية تحديد تكاثر الخلايا في الثقافة المبكرة. عندما خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة ، وجدنا أن مصل الحديد البشري يمكن أن يشمل PBMC لمدة تصل إلى أسبوعين. لقد أظهرنا أن عرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية ، لأنه يوضح شكل الخلايا وسبب التكاثر.

وهذا الامتداد للخلايا وترقيم خلايا Y-bar لبدء هذا الإجراء ، قم بتنقية PBMC الأولية من ملليلترين من الدم الكامل لمرضى CAEBV عن طريق الطرد المركزي المتدرج. بدلا من ذلك ، قم بإذابة PBMC المحفوظ بالتبريد من النيتروجين السائل باستخدام وسيط RPMI-1640. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من 0.4٪ تريبان بلو إلى 18 ميكرولترا من تعليق الخلية لتلطيخ الخلايا لمدة ثلاث دقائق ثم انقل التعليق إلى لوحة عداد الخلية وقياس تركيز الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام عداد خلية آلي.

تحضير معلق الخلية بكثافة من اثنين إلى ثلاثة أضعاف 10 إلى سادس خلايا لكل مليلتر ، مع استكمال وسط ثقافة RPMI-1640 كامل يحتوي على 20٪ مصل بشري ، ومليمولار من L-glutamine ومضادات حيوية. بعد ذلك ، قم بزرع مليلتر واحد من معلق PBMC لكل بئر في 24 لوحة زراعة خلايا البئر. بعد ذلك ، أضف 150 وحدة لكل مليلتر rhIL-2 إلى كل بئر.

ضع ألواح الاستزراع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، راقب مورفولوجيا الخلية تحت المجهر بتكبير 200 مرة. تكون الخلايا في حالة جيدة عندما تكون مشرقة ومستديرة.

في هذه الخطوة ، أضف ميكرولترين من 0.4٪ تريبان بلو إلى 18 ميكرولترا من تعليق الخلية واحسب تركيز الخلايا. بعد ذلك ، راقب مورفولوجيا الخلية وراقب حالة نمو الخلايا عن طريق ترقيم الخلايا قبل تغيير الوسط. من المهم مراقبة مورفولوجيا الخلية والحالة.

يمكننا الحكم على ما إذا كانت الخلايا تعيش من خلال الخلايا متعددة الأشكال وحالة الخلايا في المرحلة المبكرة من الثقافة. بعد ذلك ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا وأضف 500 ميكرولتر من وسط الثقافة الكاملة الطازجة إليها. ثم أضف 150 وحدة لكل مليلتر rhIL-2 إلى كل بئر.

قم بتغيير الوسيط مرتين في الأسبوع. ارسم منحنى نمو الخلية. عندما يتجاوز تركيز الخلية القابلة للحياة خمسة أضعاف الخلايا من 10 إلى ستة خلايا لكل مليلتر ، قسم الخلايا إلى آبار جديدة بتركيز واحد إلى اثنين في 10 إلى ستة خلايا لكل مليلتر في كل بئر.

هذه العملية من أسبوعين إلى أربعة أسابيع. عندما تتوسع الخلايا ، اجمع مرة واحدة من الخلايا من 10 إلى سادسة لتحديد الأنماط الظاهرية لخطوط الخلايا. قم بالطرد المركزي عند 240 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب خلايا NKNT.

بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، واغسل الترسيب بإضافة سبعة ملليلتر من PBS. جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 240 مرة في درجة حرارة الغرفة. كرر الإجراء مرة أخرى ، ثم أضف 200 ميكرولتر من المصل البشري إلى كل أنبوب ، واخلطه جيدا واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 240 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا مرة واحدة من 10 إلى سادس الخلايا لكل مليلتر مع PBSA البارد. بعد ذلك ، قسم الخلايا إلى خمسة أنابيب يحتوي كل منها على خليتين من 10 إلى خمس خلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 240 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت PBSA أو PBSA الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من البولي إيثيلين و 10 ميكرولترات من الأجسام المضادة المسماة ب FITC لتلطيخ مستقبلات الخلايا من الخلايا التائية أو الخلايا الطبيعية على الجليد.

يتم استخدام الخلايا المعلقة مع المخزن المؤقت PBSA كعنصر تحكم سلبي. بعد ذلك ، احتضن الخلايا بالأجسام المضادة لمدة 20 إلى 30 دقيقة على الجليد في الظلام. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBSA البارد وأعد تعليق الخلايا ب 300 ميكرولتر من PBSA البارد قبل التحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

عند اكتمال تحليل النمط الظاهري للخلية ، قم بإزالة نصف المادة الطافية بعناية وتجنب لمس الخلايا الموجودة أسفل اللوحة. أضف نفس الحجم من وسط الاستزراع الطازج الذي يحتوي على rhIL-2 بمعدل 300 وحدة لكل مليلتر إلى الألواح ، ثم قم بتغيير نصف الوسط كل ثلاثة أيام حتى تظهر مجموعات الخلايا بوضوح تحت المجهر. بعد ذلك ، انقل الخلايا من الألواح المكونة من 24 بئرا إلى قوارير ثقافة T-25 بعد خلط آبار مختلفة من نفس النسب.

ضاعف حجم وسط الاستزراع عندما يتحول إلى اللون الأصفر حتى يتسع حجم الوسط إلى 10 إلى 15 ملليلترا. بعد ذلك ، أضف rhIL-2 بتركيز 150 وحدة لكل مليلتر إليه. قم بتغيير الوسط قبل 24 ساعة من التجميد بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من النمو ، عندما يمكن ملاحظة كتلة الخلية بالعين المجردة.

قم بقياس تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمعلق الخلية لمدة خمس دقائق عند 240 مرة جم وأعد تعليق حبيبات الخلية بكثافة من خمسة إلى 10 أضعاف 10 إلى سادس خلايا لكل مليلتر بمحلول المخزون المجمد الذي يحتوي على 90٪ مصل بقري جنيني و 10٪ DMSO. قم بتجميده بمعدل درجة مئوية واحدة في الدقيقة إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر ثم انقله مباشرة إلى النيتروجين السائل.

بعد ثلاثة أيام من الثقافة أثناء إنشاء خطوط الخلايا ، تبدأ الخلايا متعددة الأشكال في الظهور. بعد سبعة أيام ، تنمو الخلايا بسرعة حيث زاد عدد الخلايا وقابليتها للحياة بمعدل مرتفع. تظهر مجموعات صغيرة من الخلايا بوضوح بعد 10 إلى 14 يوما من النمو ، عندما يتجاوز تركيز الخلية ثلاثة إلى ستة أضعاف 10 إلى السادس.

في هذه الفترة ، يجب توسيع الخلايا عن طريق الانقسام إلى بئرين أو ثلاثة من لوحة الثقافة. بعد حوالي شهر ، بمجرد أن يصل رقم الخلية إلى ثلاثة إلى خمسة أضعاف 10 إلى السابع ، يكون العدد مرتفعا بما يكفي للحفظ. هناك مسألة أخرى مهمة وهي تحديد الأنماط الظاهرية بعد زراعة الخلايا بنجاح.

تشير نتائجنا إلى أنه يمكن زراعة الخلايا التائية والقاتلة الطبيعية بالطريقة الموضحة أعلاه ويمكن إنشاء خطوط الخلايا بهذه التقنية حيث نمت الخلايا لأكثر من ثلاثة أشهر في حالة جيدة. هذه الطريقة ، هذه التقنية ، يمكن القيام بها أكثر. من السهل أن تؤدي بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على تباين PBMC. بالنسبة لهذا الإجراء ، يمكن إجراء أي من الطريقتين ، مثل مجموعة اختبار MTT 8 ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل سمية خطوط الخلايا القاتلة الطبيعية أو التائية التي يمكن استخدامها للعلاج المناعي بالتبني. بعد كل تطور ، تمهد هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجال CAEBV لاستكشاف آلية NK / T المرتبطة ب EBV والتي تنطوي على أمراض جراحية في نظام نموذج الخلية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء توسيع خطوط الخلايا NK و T باتباع هذا البروتوكول. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات عند تنفيذ هذا الإجراء.