بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار طريقة فعالة لإزالة الخلايا وإزالة الكلس من قوقعة الفأر لاستخدام سقالة لتطبيقات هندسة أنسجة الأذن الداخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات الهندسة السمعية والأنسجة مثل ، كيف تؤثر القوقعة ثلاثية الأبعاد والمكونات المختلفة للمصفوفة خارج الخلية على تمايز الخلايا الجذعية؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن الباحث من دراسة كيفية تفاعل الخلايا مباشرة مع المصفوفة خارج الخلية للقوقعة لتشكيل ظهارة حسية.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث قد يكون من الصعب تصور جهاز عزل العظام الصدغي ووفرة الخلايا بشكل صحيح بناء على الأوصاف النصية فقط. لبدء هذا الإجراء ، قم بتقسيم الجمجمة إلى نصفين في المستوى السهمي المتوسط باستخدام مقص جراحي حاد. بعد ذلك ، قم بإزالة أنسجة المخ من الجمجمة.

ثم تحديد العظم الصدغي من خلال وجود جذور الأعصاب السمعية والدهليزية في الجزء الداخلي من الجمجمة وقناة الأذن من الخارج. قطع الجمجمة بعناية لعزل العظم الصدغي عن بقية الجمجمة. بعد ذلك ، أدخل الملقط الدقيق في فتحة قناة الأذن حوالي خمسة ملليمترات حتى لا تخاطر الأطراف بثقب القوقعة.

افتح عظم البركة برفق حتى ينكسر. باستخدام ملقط ناعم ، انزع ما تبقى من البلة من العظم الصدغي مما يكشف المتاهة العظمية للقوقعة. بعد ذلك ، اغمر العظم الصدغي في PBS مع توجيه النوافذ البيضاوية والمستديرة للقوقعة لأعلى.

باستخدام زوج فائق النعومة من الملقط ، قم بإزالة الشريان العصبي الذي يمر عبر الدعاود. ثم أدخل طرفا واحدا من الملقط فائق الدقة من خلال قوس الركاب حيث يمر الشريان ويرفع الركاب برفق لأعلى. بعد ذلك ، ثقب النوافذ البيضاوية والمستديرة.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب المتصل بحقنة قياس 28.5 مملوءة ب PBS فوق النافذة البيضاوية. قم بإنتاج ملليمترين من 10٪ مضاد حيوي - أتيميكوتيك و 10٪ بنسلين - ستربتومايسين في PBS من خلال القوقعة على مدى خمس دقائق لإزالة perilymph. ثم قم بإزالة والتخلص من أي أنسجة عضلية وشظايا عظام متبقية.

لإزالة الخلايا ، باستخدام ماصة النقل ، اسحب القوقعة برفق إلى الماصة بحيث تمر فقط بحافة القطع ببضعة ملليمترات. بعد ذلك ، طرد القوقعة في قارورة التلألؤ المملوءة بمحلول SDS بنسبة 1٪. قم بتدوير ملليلترين من 1٪ SDS في الماء منزوع الأيونات عبر القوقعة في قارورة التلألؤ باستخدام ماصة نقل.

ضع قارورة التلألؤ في دوار واتركها تدور بسرعة 10 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استبدلها بمحلول SDS جديد بنسبة 1٪ كل 24 ساعة على مدار 72 ساعة واحرص على عدم تعريض القوقعة للهواء أثناء استبدال المحلول. بعد ذلك ، اغسل القوقعة ثلاث مرات في نفس قارورة التلألؤ لمدة 30 دقيقة لكل منها في ماء DI.

في هذه المرحلة ، يجب إزالة القوقعة من الخلايا. لإزالة الكلس، قم بإزالة ماء DI المتبقي من قارورة التلألؤ مع ترك ما يكفي لإبقاء القوقعة مغمورة. لبدء إزالة الكلس، أضف خمسة ملليلتر من 10٪ EDTA وماء DI إلى قارورة التلألؤ التي تحتوي على القوقعة.

قم بتدوير ملليلترين من 10٪ EDTA في ماء منزوع الأيونات عبر القوقعة في قارورة التلألؤ باستخدام ماصة نقل. ضع قارورة التلألؤ مرة أخرى في الدوار واترك قارورة التلألؤ تدور عند 10 دورات في الدقيقة لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بتغيير حل 10٪ EDTA كل 24 ساعة على مدار 72 ساعة.

توخ الحذر عند تغيير المحاليل حتى لا تتعرض القوقعة للهواء. ثم اشطف القوقعة ثلاث مرات لمدة ساعتين كل منها باستخدام PBS. في هذه المرحلة ، يجب إزالة الكلس من القوقعة.

قبل غرس الخلايا ، ابدأ باحتضان القوقعة المنزوعة الكلية والمتكلسة في حاضنة ثقافة خلايا 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. لإفراز القوقعة ، أضف بعد ذلك قطرة من MSCGM إلى كل قوقعة لمنع أي قوقعة من الجفاف. انقلها إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا باستخدام ماصة نقل.

قم بتوجيه القوقعة بدقة باستخدام ملقط فائق الدقة بحيث تكون النوافذ البيضاوية والمستديرة متجهة لأعلى. ثم باستخدام حقنة أنسولين معقمة عيار 28.5 مع أنابيب متصلة ، ارسم 0.2 مل من خلايا الهلام البشرية المعلقة معاد تعليقها. بعد ذلك ، ضع الأنبوب فوق النافذة البيضاوية باستخدام ملقط دقيق معقم.

بغزارة القوقعة بدقة وببطء مع 0.2 مل من خلايا الهلام البشرية المعلقة على مدار خمس دقائق. هذه الخطوة الوفيرة مهمة. يؤثر الوفرة الناجحة للسوائل من خلال القوقعة بشكل كبير على نتيجة هذا البروتوكول.

بعد الوفرة ، أضف 0.8 مل من 37 درجة مئوية MSCGM الدافئ مسبقا إلى البئر الذي يحتوي على قوقعة الأذن ليصل الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد. كرر الإجراء لكل قوقعة. باستخدام حقنة وأنابيب جديدة في كل مرة.

ضع القوقعة الغزيرة في حاضنة زراعة الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتغيير الوسائط ثلاث مرات في الأسبوع. يظهر هنا إزالة الخلايا الناجحة وإزالة الكلس من قوقعة الفأر دون أي خلايا محقونة. بشكل عام ، يتم الحفاظ على تشريح القوقعة مع ترك فراغات بدون تلطيخ خفيف.

فيما يلي النتائج التمثيلية لخلايا الهلام البشرية وارتون المستزرعة بنجاح على سقالة قوقعة. لوحظ تلطيخ غني وفير في جميع أنحاء القوقعة وعلى السطح العظمي الخارجي. يكشف الفحص الدقيق للمنعطفات الفردية أن هياكل القوقعة الدقيقة يتم الحفاظ عليها بعد إزالة الخلايا وإزالة الكلس وأن الخلايا المحقونة مرتبطة بمصفوفة القوقعة الأصلية خارج الخلية أو تتفاعل معها.

كما تم التحقيق في إزالة الخلايا في زراعة الخلايا اللاحقة باستخدام تلطيخ H & E. لم تحتوي القوقعة المنزوعة الخلايا على أي من خلايا القوقعة الأصلية ولكنها تحتفظ بمعظم تشريح عضو كورتي لأن المصفوفة خارج الخلية لا تزال قائمة. يمكن ملاحظة الحقن في الخلايا المستنبتة من خلال عضو كورتي ، ويتفاعل مع المصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا.

بمجرد إتقانها ، يمكن أن يستغرق وفرة الخلايا في قوقعة منزوعة الخلايا حوالي 10 إلى 15 دقيقة إذا كانت القوقعة معدة بالفعل وتم وضع الأدوات المطلوبة بشكل مناسب. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التعامل مع القوقعة بحذر لأنها هشة. من المهم أيضا تجنب دخول الهواء إلى القوقعة لأن الفقاعات ستمنع تدفق السوائل أثناء الوفرة.

يمكن تطبيق هذا الإجراء العام على القوقعة من الأنواع الأخرى ويمكن أيضا حقن مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. من المحتمل أن تختلف أوقات إزالة الخلايا وإزالة الكلس المحددة ولكن المفاهيم الأساسية ستظل كما هي. طور الدكتور بيتر سانتي من جامعة مينيسوتا في البداية تقنية إزالة الخلايا التي قمنا بتعديلها لهذا البروتوكول.

نأمل في إتاحة تقنيتنا وزراعة الخلايا على سقالة القوقعة لمهندسي الأنسجة الآخرين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل العظام الصدغية وإزالة الخلايا منها وإزالة الكلس منها بنجاح قبل حقن الخلايا لاستخدامها في تجارب الاستزراع.