Name: توليف وتقييم مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستندة إلى الروثينيوم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: تعلم توليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستند إلى الروثينيوم بفعالية عالية. يوفر هذا البروتوكول أداة نقية وقوية لدراسة وظائف الميتوكوندريا في الخلايا الثديية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا البحث جامعة كورنيل. هذا العمل باستخدام مركز كورنيل "المرافق المشتركة البحث المواد"، هي معتمدة من خلال برنامج مرسيك جبهة الخلاص الوطني (هيئة الهجرة واللاجئين منحة--1120296). وتسلم S.R.N. الدعم بزمالة بحثية الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني (منحة تأيين-1650441) والدكتور ديف Holowka للمساعدة مع هذه التجارب الكالسيوم. أي رأي، النتائج التي توصل إليها، والاستنتاجات أو التوصيات التي أعرب عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (s)، ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر "المؤسسة الوطنية للعلوم".

ملاحظة : تركيز الأحماض والقواعد المستخدمة في هذا التوليف. استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند القيام برد فعل بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان) ومعدات الحماية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية) بما في ذلك سلامة النظارات والقفازات ومعطف مختبر، وكامل طول السراويل وأحذية أغلقت تو.
 1. إعداد [(أوه 2) (NH 3) 4 رو (μ س) رو (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>توليف Cl [Cl 5 رو (NH 3)] 2 12 <ol><li>ز حل 1.00 روكل 3 · ن ح 2 س (40% رو بالوزن، 4.1 mmol) في 5 مل ح 2 سين بارد الحل البنى الداكن إلى 0 درجة مئوية في حمام الثلج. إضافة مل 11 (0.23 mol) من حل هيدرات الهيدرازين 80% بطريقة دروبويسي. رد الفعل الأولى ستكون قوية مع تطور الغاز، أسفر عن حل براون. واسمحوا أن الحل الناجم عن ذلك ضجة في درجة حرارة الغرفة ح 16؛ أن الحل النهائي سيكون احمرت الظلام 
		تنبيه: الهيدرازين حادة السمية والمسببة للسرطان. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر اللامائى أشكال هذا الكاشف المتفجرات. كما هو الحال دائماً، استخدم أغطية معدات الوقاية الشخصية والأبخرة المناسبة عند التعامل. لم تركز هذه الحلول إلى جفاف.</li>
		<li>لهذا الحل، قم بإضافة ما يقرب من 5-10 مل HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2. عند هذه النقطة، سيكون الحل بني أصفر اللون.</li>
		<li>الحرارة هذا الحل عند 105 درجة مئوية بينما التحريك ح 1-2. مادة صلبة صفراء سوف يعجل بالخروج من الحل. عندما يعجل لا أكثر وضوحاً أشكال، إزالة من الحرارة.</li>
		<li>السماح برد فعل الخليط يبرد لدرجة حرارة الغرفة، ومن ثم ضع في حمام الثلج 0 درجة مئوية لجمع 10 دقيقة صلبة صفراء بفراغ الترشيح والغسيل مع مل 5 كل من الإيثانول وثنائي إثيل الاثير.</li>
		تماما حل <li>النفط الخام المنتج في 15-25 مل ماء الساخن. تشيل 10 مل حل HCl تتركز في قارورة تصفية بوضعه في حمام الثلج. تصفية الحل الأصفر إلى حل HCl مبردة للحث على هطول الأمطار صلبة نقية أصفر باهت. تصفية هذا متسرعا وتغسل مع 5 مل من 0.5 M HCl، الإيثانول والبروم ثنائي الفينيل-</li>
		مطيافية الأشعة تحت الحمراء <li>تميز باستخدام مجمع. تحقق من النقاء بتحديد الترددات وتمتد في سم 3226 -1 و 1604 سم -1 سم 1297 -1 سم 801 -1. يتم تعيينه الحدث الأصغر مشترك في سم 2069 -1 إلى [رو (NH 3) 5 ن 2] Cl 3-</li>
	</ol></li> <li>توليف من [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 <ol><li>حل 100 مغ (0.34 ملمول) [رو (NH 3) 5 Cl] Cl 2 في 50 مل من م 1 NH 4 يا في وعاء ضغط القاع المستديرة ثقيلة جدار 200 مل. كاب قارورة مع سداده فضفاضة وتسخين المخلوط رد الفعل عند 75 درجة مئوية ل h. 6 إزالة من الحرارة ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 أيام تسفر عن حل أخضر داكن. 
		تحذير! تدفئة نتائج سفينة مختومة في تراكم ضغط. تأكد من استخدام الأواني الزجاجية الآمنة للضغط المناسب. لرد الفعل هذا، أن الغرض من ختم السفينة تقليل الخسائر في الغازية NH 3. ولذلك، ضع سداده فضفاضة للسماح بالإفراج عن الضغط الزائد.</li>
	</ol></li> <li>تنقية اللوني لتبادل الأيونات الموجبة <ol><li>في كوب 25 مل، تعليق ز 5 راتنج تبادل الأيونات الموجبة (مثلاً شبكة دو 50WX2 200-400 (نموذج ح +) في 10 مل م 0.1 HCl.</li>
		<li>تحميل هذا الملاط إلى عمود 10 مل (10 مم، الارتفاع 15 سم) الملصقة بخزان مذيب 50 مل. أغسل الراتنج مع ما يقرب من 20-30 مل من 0.1 M HCl، حتى النذرة عديم اللون.</li>
		<li>العودة إلى حل الرد الأخضر معزولة في خطوة 1.2.1. لهذا الحل، قم بإضافة HCl مركزة لضبط درجة الحموضة إلى 2، النقطة التي يتغير لون الحل إلى براون-</li>
		<li>تحميل هذا الحل المحمضة إلى العمود راتنج تبادل الأيونات الموجبة أعده في خطوة 1.3.2 بلطف بيبيتينج أنه على رأس الراتنج. واسمحوا النذرة تماما الصرف، ومتابعة تحميل الحل. كرر هذه العملية حتى تم إضافة الحل الكامل. وسيكون الأعلى من الراتنج بني داكن/أسود. الراتنج ستنخفض في حجم قليلاً.</li>
		<li>استخدام الزجاج الخرز لتغطية الجزء العلوي من الراتنج. هذه سيمنع الراتنج من يجري بالانزعاج عندما تتم إضافة حلول جديدة-</li>
		<li>الوت العمود مع 20 مل من 1 M HCl.</li>
		<li>الوت العمود مع زيادة تركيز HCl 1.5 متر (&#8776; 50 مل). حلاً أصفر ستبدأ بالخروج من العمود. زيادة تركيز HCl إلى 2 متر وتستمر التينج حتى النذرة عديم اللون أو أصفر أخضر شاحب جداً. إجمالي 150-200 مل ستكون مطلوبة من أجل هذه العملية.</li>
		<li>زيادة تركيز HCl إلى 2.5 م (20-50 مل). جمع النذرة كالكسور في أنابيب الاختبار. تزيد على 3 M HCl. وسوف الوت المنتج من العمود كحل الأخضر والبنى. قد تبدأ صغيراً أحمر اللون البنى أيضا يأتي الخروج من العمود. كما هذه الكسور الأحمر المؤكسد الروثينيوم من الشوائب، لا تجمع مع كسور الأخضر والبنى-</li>
	</ol></li> <li>توصيف والتحقق من نقاء] (NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2) [Cl 5 <ol><li>اختبار كل من الكسور من الخطوة 1.3.8. طريق التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية. لإنجاز هذه المهمة وإضافة 100 ميليلتر من جزء معين في 2 مل 3 M NH3 وتحليل جانب مطيافية الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة. الكسور التي تحتوي على منتجات نقية سيكون عصابة امتصاص كبير في 360 نيوتن متر وامتصاص أقل كثافة في 600 نانومتر. امتصاص في 480 أو 533 nm الإرشادية الروثينيوم المؤكسد أحمر وأحمر الروثينيوم من الشوائب، على التوالي.</li>
		<li>تجمع الكسور التي تحتوي على منتجات نقية وتتبخر الحل لجفاف بتبخر دوارة. وسوف يكون المنتج معزولة صلبة الأخضر والبنى. غلة عادة تتراوح بين 5-15 ملغ (10-20% العائد). يمكن الحصول على واحد--بلورات، مناسبة حيود الأشعة السينية، بنشر بخار الإيثانول في المحاليل المجمع.</li>
		تحليل <li>للتحقق من النقاء، المجمع بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية في إيجاد حل لدرجة الحموضة 7.4 مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). يمكن تقييم نقاء بأخذ نسبة كثافة 360 نيوتن متر و 600 نانومتر القمم. وهذه النسبة هي 31 لمجمع نقية. للمركبات النجسة، ستكون النسبة أصغر.</li>
		<li>تحليل العينة في الحالة الصلبة واسطة مطيافية الأشعة تحت الحمراء. تكون الأشرطة التشخيص على 3234 سم -1 سم 3151 -1، سم 1618 -1، سم 1313 -1 وسم 815 -1. تعتبر مشتركة شوائب العصابات في 1762 سم -1 و 1400 سم -1, مميزة من NH 4 أحمر الروثينيوم ألغ يمكن تحديد الفرق في سم 1404 -1 و 800 سم -1 سم 1300 -1، سم 1037 -1-</li>
	</ol></li> <li>التقييم لتثبيط امتصاص الكالسيوم المتقدرية بالأسفار التحليل الطيفي تنبيه! الإجراءات التالية استخدام خلايا الثدييات. وينبغي أن يجري العمل في أغطية الاندفاق الصفحي المناسبة التي هي معتمدة للسلامة البيولوجية من المستوى 2 (BSL2) البحوث. 
	&#8203; ملاحظة: [(NH 3) (أوه 2) 4 رو رو (μ س) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 سوف يشار إليها باسم [رو] في هذا القسم <ol><li>جعل مخزنة المحتوية على السكر المحلول الملحي (بجس) كما تحليل وسائل الإعلام. بجس حل تضم 110 مم بوكل، مم 1 خ 2 ص 4، 1 مم مجكل 2، 20 مم 4 حمض-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس)، سوكسيناتي الصوديوم 5 مم، 30 ميكرون جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-ن، ن ، ن &#39;، ن &#39;-حمض tetraacetic (اجتا). الجمع بين كل شيء ما عدا اجتا، وضبط pH إلى 7.4. إضافة اجتا وتعدل pH إلى 7.4. 50 مل بمقايسة وسائط إضافة 0.5 مل السكر 1 ملغ/مل.</li>
		<li>خلايا "هيلا الثقافة" في 500 سم 2 أطباق بيتري في دولبيكو &#39; s التعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) في حاضنة هوميديفيد مع 5% CO 2 في 37 ° "هيلا تضخيم جيم" الخلايا تنمو في 100 مم طبق بيتري ببذر لهم في طبق بتري 500 سم 2. أن حجم مجموع وسائل الإعلام في الطبق الكبير 115 مل. وسيؤدي كل طبق كبير حوالي 18 مليون الخلايا، ما يكفي للتحليل الطيفي fluorescence تجربتين.
		<ol><li>تنمو الخلايا حتى تصل إلى 90-95% كونفلوينسي. قم بإزالة الوسائط، وشطف الخلايا مع 15 مل الأس الهيدروجيني 7.4 برنامج تلفزيوني. إضافة 15 مل حمض الإيثيلين 1 مم (يدتا) في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى مل 14 جولة أسفل الصقر أنابيب</li></ol></li> <li>عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير مع مجهر مقلوب، وحساب إجمالي عدد الخلايا وحجم الوسائط اللازمة للوصول إلى الخلايا 7.5 مليون في حجم 1.8 مل من المتوسطة. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 5310 × زاي صب المادة طافية وإضافة حجم المحسوبة من بجس. ريسوسبيند الخلايا بلطف.
		<ol><li>لهذا التحليل، إعداد حلول الأسهم من ديجيتونين 40 مم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، 1 مم الكالسيوم الأخضر-5N في ح 2 س، و 10 مم كاكل 2 في 2 ح سين [رو] الأسهم الحلول، أعدت في المياه النقية، ويمكن أن تتراوح بين 1-3 مم- 
			&#8203; ملاحظة: الكالسيوم الأخضر-5N حساسة للضوء. تخزين في الظلام والتقليل من التعرض للضوء.</li>
		</ol></li> <li>الإعداد فلوريميتير إثارة في 506 نانومتر والقراءة الانبعاثات في 532 نانومتر مع صاحب ومبومو يسيطر على 37 ° جيم تحضير ومبومو اكريليك مع شريط ضجة أو عجلة، تعليق خلية 1.8 مل من 1.5.2 أعلاه، 1.8 ميليلتر ديجيتونين الحل، 3.6 & #181؛ الكالسيوم L الأخضر-5N (الحل)، وميليلتر 9 [رو] (للحل الأسهم 1 مم، 5 ميكرومتر التركيز النهائي). احتضان خلايا لمدة 15 دقيقة في فلوريميتير.
		<ol><li>قراءة البيانات كنسبة الإثارة/الانبعاثات بدلاً من استيعاب الخام. هذه الممارسة يقلل الأخطاء المرتبطة بالتقلبات في كثافة مصدر الضوء.</li>
			<li>القيام بتحليل العينة الأولى في الغياب [رو] لقياس تأثير إضافة كاكل 2 على استجابة الخلايا.</li>
			<li>التحليل تبدأ في فلوريميتير مع الإعدادات الموضحة في 1.5.4. الانتظار حوالي 2 دقيقة وضع خط أساس انبعاثات مستقرة، ثم قم بإضافة ميليلتر 1.8 كاكل 2 (10 ميكرون تركيز النهائي). كثافة الانبعاثات ستزيد فورا عند إضافة كاكل 2، وسوف تسوس على مدى دقائق ثم دخول أيونات الكالسيوم الميتوكوندريا. انتظر حتى ينتهي الانحلال (&#8776; 5 دقائق). إضافة بلعات الكالسيوم الإضافية لتحديد استجابة الخلايا لا تعامل مع [رو] امتصاص الكالسيوم المتقدرية.</li>
		</ol></li> <li>في ومبومو آخر يحتوي على 5 ميكرومتر [رو]، كرر التجربة كما هو موضح أعلاه في 1.5.4.3. حضور المانع، كثافة الانبعاثات تزيد، لكن ليس الاضمحلال. وهذه الملاحظة تعني حظر امتصاص الكالسيوم المتقدرية.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 يمكن أن يكون المركب من [رو (NH3)5Cl] Cl2، ruthenium(III) معروفة جيدا ابتداء من المواد، كما هو موضح في هذا الإجراء. ويتحقق التوليف [رو (NH3)5Cl] Cl2 سهولة دون صعوبة تذكر. وبعد إثارة روكل3 لح 16 في هيدرازين هيدرات، ينبغي تعديل درجة حموضة الحل بقيمة 2 مع HCl. انخفاض الأس الهيدروجيني أمر حاسم لتحقي...

الكالسيوم المتقدرية هو منظم رئيسي لعدد من العمليات التي تعتبر حاسمة بالنسبة لوظيفة الخلية العادية، بما في ذلك إنتاج الطاقة والمبرمج. 1 , 2 , 3 أونيبورتير الكالسيوم المتقدرية (MCU)، بروتين الناقل أيون موجودة على غشاء الميتوكوندريا الداخلية، وينظم تدفق أيونات الكالسيوم في الميتوكوندريا. 4 , 5 , 6 الكيميائية مثبطات MCU أدوات قيمة لمواصلة الجهود الرامية إلى دراسة وظائف وأدوار الخلوية هذا النقل البروتين والكالسيوم المتقدرية. مجمع] (NH3) (HCO2)4رو رو (μ س) (NH3)4(س2CH) [3 +، Ru360، واحد من مثبطات انتقائية المعروفة فقط ل MCU مع قيمةد ك المبلغ عنها من 24 ميكرومتر.7 8، ،،من910 هذا المجمع شوائب مشتركة الموجودة في المستحضرات التجارية من الروثينيوم الأحمر (روريد)، اثنا دي-μ-أوكسو سد هيكساكاتيون الصيغة (NH]3) 5 رو (μ س) رو (NH3)4(μ س) رو (NH3)5)]6 +، التي استخدمت أيضا كمثبط امتصاص كالسيوم. على الرغم من أن Ru360 المتاحة تجارياً، أنها مكلفة للغاية. وعلاوة على ذلك، طعن التوليف وعزل Ru360 تنقية صعوبة إجراءات وأساليب توصيف غامضة.
ونحن قد أبلغت مؤخرا بإجراءات بديلة الوصول إلى Ru360 التماثلية، [(NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 يمنع هذا المركب MCU مع تقارب عالية، مماثلة ل Ru360. في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف لدينا توليف الأكثر فعالية لهذا المركب، الذي يبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2. هو مفصل تنقية المنتج باستخدام راتنج تبادل الأيونات الموجبة الحمضية بشدة، جنبا إلى جنب مع المخاطر الشائعة لهذا الإجراء. ونحن أيضا أساليب لتوصيف وتقييم درجة نقاء مجمع، وتحدد نهج بسيط لاختبار فعاليته في منع امتصاص الكالسيوم المتقدرية.

مادة <table><tbody><tr><td>كيميائية</td> <td>لضغط هيدرات ثلاثي كلوريد الروثينيوم</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>حمض الهيدروكلوريك المركز</td><td>جي تي بيكر</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>هيدروكسيد الأمونيوم المركز</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>أخضر الكالسيوم 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>سكسينات الصوديوم</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 قارورة دائرية القاع</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>سدادة زجاجية</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>عمود زجاجي 10 مم × 15 سم مع خزانات</td><td>مخصص - مشابه لأعمدة Chemglass</td><td>مماثل ل CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الصقر المستديرة القاع</td><td>فيشر Scientific</td><td>14-959-11B &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 سم < سوب > 2 < / سوپ > أطباق بتري</td><td>كورنينج</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>تريبان الأزرق</td><td>ثيرموفيشر 15250061</td><td></td><td></td>العلم</tr> مقياس <tr><td>الدم</td><td>ألدريتش</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>أكريليك كوفيت</td><td>VWR &nbsp ؛</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>مطياف الأشعة فوق البنفسجية المرئية</td><td>Agilent نموذج Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقياس الطيف الفلوري</td><td>SLM نموذج 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مطياف الأشعة تحت الحمراء</td><td>Bruker Hyprion FTIR مع مرفق</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>جهاز طرد</td><td>مركزي ALC نموذج PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر ضوئي مقلوب</td><td>VWR & nbsp ؛</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

توليف وتقييم مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستندة إلى الروثينيوم

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

ونحن بالتفصيل التوليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية،] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [5 +. التوليف الأمثل من هذا المركب تبدأ من [رو (NH3)5Cl] Cl2 في 1 م NH4يا في حاوية مغلقة، مما أسفر عن حل أخضر. ويتم إنجاز تنقية مع الفصل اللوني لتبادل الأيونات الموجبة. يتميز هذا المركب والتحقق من أن تكون نقية بالتحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء. خصائص امتصاص الكالسيوم المتقدرية المثبطة يقيمها fluorescence التحليل الطيفي في خلايا هيلا بيرميبيليزيد.

يصف هذا الأسلوب توليفة من الكالسيوم المتقدرية امتصاص المانع] (NH3) (أوه2)4رو رو (μ س) (NH3)4(OH2) [Cl5 ابتداء من [رو (NH3)5Cl] Cl2، انطلاق المواد ruthenium(III) معروفة جيدا. [Cl5رو (NH3)] Cl2 يتميز بطيف الأشعة تحت الحمراء، مع وسائط الذبذبات في 3200 سم-1و 1608 سم-1سم 1298-1سم 798-1 (ال...

ويرد وضع بروتوكول للتوليف وتنقية، وتوصيف مثبط على أساس الروثينيوم لامتصاص الكالسيوم المتقدرية. ويتجلى إجراء تقييم فعاليته في خلايا الثدييات بيرميبيليزيد.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

الهدف العام من التخليق والتنقية هو إنتاج تناظرية من الروثينيوم 360 بسهولة نسبيا المستخدمة في فحوصات امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا والتي تكون أكثر فعالية 10 مرات من الروثينيوم 360 المتاح تجاريا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال توفير مثبط نقي لامتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المنتج النهائي قوي جدا ونقي.قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التطهير يتطلب الوقت والصبر. ستظهر المنتجة سارة ناثان ، طالبة دراسات عليا من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بتخليق ثنائي كلوريد البنتاأمين كلورو روثينيوم كما هو موضح في بروتوكول النص.قم بإذابة 100 ملليغرام من ثنائي كلوريد البنتاأمين كلورو روثينيوم في 50 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المولي في قارورة قاع مستديرة سعة 200 مل. قم بتغطية القارورة بسدادة زجاجية وقم بتسخين خليط التفاعل على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ست ساعات. يؤدي تسخين وعاء محكم الغلق إلى تراكم الضغط.تأكد من أن السدادة الزجاجية مفكوكة للسماح بتحرير الضغط الزائد. بعد ست ساعات ، أخرج خليط التفاعل من الحرارة. ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة أربعة أيام للحصول على محلول أخضر داكن.لتنقية أنبر-دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني ، قم أولا بتعليق خمسة جرامات من راتنج التبادل الكاتيوني الشبكي في 10 ملليلتر من 0.1 مولار HCL في دورق 25 ملليلتر. قم بتحميل هذا الملاط في عمود سعة 10 مليلتر مثبت بخزان مذيب سعة 50 مل. اغسل الراتنج بحوالي 20 إلى 30 مل من 0.1 مولار HCL حتى يصبح اللوت عديم اللون.بعد ذلك ، أضف حمض الهيدروكلوريك المركز إلى محلول التفاعل الأخضر المعزول مسبقا لضبط الرقم الهيدروجيني إلى اثنين ، وعند هذه النقطة يتغير لون المحلول إلى اللون البني. قم بتحميل هذا المحلول المحمض على عمود راتنج التبادل الكاتيوني عن طريق ماصته برفق فوق الراتنج. دع المحلول يستنزف تماما واستمر في تحميل المحلول.كرر هذه العملية حتى تتم إضافة الحل بالكامل. سيكون الجزء العلوي من الراتنج بني غامق أو أسود. سوف ينخفض حجم الراتنج قليلا.بعد ذلك ، قم بتغطية الجزء العلوي من الراتنج بخرز زجاجي لمنع إزعاج الراتنج عند إضافة محاليل جديدة. قم بتخطيب العمود ب 20 مل من حمض واحد من حمض الهيدروكلورايد الواحد. ثم قم بمسح العمود ب 50 مل من تركيز HCL المتزايد البالغ 1.5 مولار.سيبدأ المحلول الأصفر في الخروج من العمود. بعد ذلك ، قم بزيادة تركيز HCL إلى اثنين من الملاريين واستمر في التصفية بمقدار 150 إلى 200 ملليلتر. سيبدأ الطلاء باللون الأصفر الباهت جدا ويذهب إلى اللون الأصفر الفاتح.انتظر حتى يصبح الشطف القادم من العمود شاحبا جدا مرة أخرى. الصبر أمر بالغ الأهمية في هذه الخطوة. يجب أن يكون الطلاء شاحبا جدا.زيادة تركيز حمض الهيدروكلوريك إلى 2.5 مولار. اجمع المشتعث ككسور في أنابيب الاختبار. أخيرا ، قم بزيادة التركيز إلى ثلاثة مولار HCL.سوف يتخلص المنتج من العمود كمحلول أخضر بني. قد يبدأ الكسر الأحمر والبني أيضا في الخروج من العمود. هذه الكسور عبارة عن شوائب بنية الروثينيوم ولا ينبغي تجميعها مع الكسور الخضراء والبنية.لاختبار جميع الكسور بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية والبصرية، أضف 100 ميكرولتر من جزء معين إلى ملليلترين من ثلاثة أمونيا مولية. ثم قم بتحليل الخليط عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. سيكون للكسور التي تحتوي على منتج نقي نطاق امتصاص كبير عند 360 نانومتر وامتصاص أقل كثافة عند 600 نانومتر.يدل الامتصاص عند 480 نانومتر على اللون البني الروثينيوم والامتصاص عند 533 نانومتر يمثل شوائب الروثينيوم الحمراء. تظهر الشوائب الأخرى عند امتصاص أقل من 300 نانومتر. كسور تجمع تحتوي على منتج نقي وتبخر المحلول إلى الجفاف عن طريق التبخر الدوار قبل تحليل العينة في الحالة الصلبة بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء.تابع تقييم تثبيط امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا عن طريق التحليل الطيفي الفلوري كما هو مفصل في بروتوكول النص. تتميز أطياف UV-Vis من أنقاة عبر دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد بامتصاصات رئيسية وطفيفة عند 360 نانومتر و 600 نانومتر على التوالي. على العكس من ذلك ، يظهر الخليط غير النقي نطاقات امتصاص عند 533 نانومتر من الشوائب الحمراء الروثينيوم وعند 275 إلى 300 نانومتر من مادة البداية.توصيف الحالة الصلبة باستخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء له الامتدادات المتوقعة من الأمينات. بالإضافة إلى أكسجين الروثينيوم ، يمتد الروثينيوم عند 850 سم معكوس. تظهر خلايا HeLa المتنفذة المعالجة بصبغة فلورية حساسة للكالسيوم وعبر دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد تثبيط امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا.أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر السماح للكسور بالتآكل تماما. الصبر سينتج عنه منتج نقي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتنقية وتوصيف هذا التناظرية القوية من الروثينيوم 360.تنظم مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا مجموعة واسعة من العمليات بين الخلايا بما في ذلك الطاقة الحيوية وموت الخلايا الخاضع للرصد. يمكن تطبيق المثبط الناتج عن هذه الطريقة في الدراسات لفهم دور بيولوجيا الكالسيوم في الميتوكوندريا في التوسط في العمليات البيولوجية الأخرى. لا تنس أن العمل مع الأحماض والقواعد المركزة يسبب التآكل ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

JoVE Journal

Chemistry

الكيمياء

يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم...

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

يصف هذا الفيديو فحصا قائما على قارئ اللوحة لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الميتوكوندريا المعزولة. يحلل الاختبار إشارة التألق لصبغة فلورية حساسة للكالسيوم لدراسة حركية امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا والحمل الزائد للكالسيوم.

فحص امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا: طريقة قائمة على قارئ الألواح لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا المعزولة

يصف هذا الفيديو مقايسة قائمة على التصوير المجهري متحد البؤر لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا المستزرعة. يستخدم الاختبار صبغة الفلورسنت الحساسة للكالسيوم Rhod-2 / AM لقياس كالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا المستنبتة المنفذة.

مقايسة تدفق الكالسيوم لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في الخلايا المستنبتة

وتستخدم على نطاق واسع المجمعات الروثينيوم الفوسفين للتفاعلات الحفازة متجانسة مثل hydrogenations. وتفيد التقارير تخليق سلسلة من رواية المجمعات ثلاثي الشعب الروثينيوم تحمل N -triphos يجند N (CH 2 PPH 2) 3. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف رد فعل متكافئة من المجمع dihydride Ru- N -triphos مع حمض الليفولينيك.

والتجميعي، توصيف والتفاعلية من سلسلة من الروثينيوم<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; فتاه</sup&gt; مجمعات

يمكن الميتوكوندريا الاستفادة من إمكانات الكهروكيميائية عبر الغشاء الداخلي من (Δ Ψm) لعزل الكالسيوم (الكالسيوم 2+)، مما يتيح لهم تشكيل الكالسيوم عصاري خلوي 2+ يشير داخل الخلية. نحن تصف طريقة لقياس وقت واحد الميتوكوندريا الكالسيوم 2+ امتصاص وΔΨ م في الخلايا الحية باستخدام الأصباغ الفلورية والفحص المجهري متحد البؤر.

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة لفحص Ca2 + الاحتفاظ بالقدرات و Ca2 +--أثارت الخلايا المتقدرية تورم في الميتوكوندريا المعزولة من ش SY5Y خطوة بخطوة.

Ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

نقدم هنا، بروتوكولين لقياس المتقدرية Ca2 + تدفق في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المزروعة. الميتوكوندريا المعزولة، ونحن بالتفصيل لوحة المستندة إلى القارئ Ca2 + استيراد الفحص باستخدام Ca2 + حساسة صبغ الكالسيوم الأخضر-5N. للخلايا المستزرعة، يصف لنا طريقة الفحص المجهري [كنفوكل] استخدام Ca2 + صبغ Rhod-2/م.

تحليلات لتدفق الكالسيوم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة والخلايا المستزرعة

يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.

تصوير الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs)

التكيف الأيضي أمر أساسي للخلايا التائية لأنه يملي التمايز والثبات والسمية الخلوية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول محسن لمراقبة التنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتمايزة خارج الجسم الحي السيتوكين .

الرصد في الوقت الحقيقي للتنفس الميتوكوندريا في الخلايا التائية الأولية البشرية المتباينة بالسيتوكين

تعلم توليف وتنقية مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستند إلى الروثينيوم بفعالية عالية. يوفر هذا البروتوكول أداة نقية وقوية لدراسة وظائف الميتوكوندريا في الخلايا الثديية.

توليف وتقييم مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستندة إلى الروثينيوم

استكشف المزيد من الفيديوهات