توليف وتقييم مثبط امتصاص الكالسيوم المتقدرية المستندة إلى الروثينيوم

الهدف العام من التخليق والتنقية هو إنتاج تناظرية من الروثينيوم 360 بسهولة نسبيا المستخدمة في فحوصات امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا والتي تكون أكثر فعالية 10 مرات من الروثينيوم 360 المتاح تجاريا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الكالسيوم في الميتوكوندريا من خلال توفير مثبط نقي لامتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المنتج النهائي قوي جدا ونقي.

قد يكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التطهير يتطلب الوقت والصبر. ستظهر المنتجة سارة ناثان ، طالبة دراسات عليا من مختبري. ابدأ هذا الإجراء بتخليق ثنائي كلوريد البنتاأمين كلورو روثينيوم كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بإذابة 100 ملليغرام من ثنائي كلوريد البنتاأمين كلورو روثينيوم في 50 مل من محلول هيدروكسيد الأمونيوم المولي في قارورة قاع مستديرة سعة 200 مل. قم بتغطية القارورة بسدادة زجاجية وقم بتسخين خليط التفاعل على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ست ساعات. يؤدي تسخين وعاء محكم الغلق إلى تراكم الضغط.

تأكد من أن السدادة الزجاجية مفكوكة للسماح بتحرير الضغط الزائد. بعد ست ساعات ، أخرج خليط التفاعل من الحرارة. ويقلب في درجة حرارة الغرفة لمدة أربعة أيام للحصول على محلول أخضر داكن.

لتنقية أنبر-دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني ، قم أولا بتعليق خمسة جرامات من راتنج التبادل الكاتيوني الشبكي في 10 ملليلتر من 0.1 مولار HCL في دورق 25 ملليلتر. قم بتحميل هذا الملاط في عمود سعة 10 مليلتر مثبت بخزان مذيب سعة 50 مل. اغسل الراتنج بحوالي 20 إلى 30 مل من 0.1 مولار HCL حتى يصبح اللوت عديم اللون.

بعد ذلك ، أضف حمض الهيدروكلوريك المركز إلى محلول التفاعل الأخضر المعزول مسبقا لضبط الرقم الهيدروجيني إلى اثنين ، وعند هذه النقطة يتغير لون المحلول إلى اللون البني. قم بتحميل هذا المحلول المحمض على عمود راتنج التبادل الكاتيوني عن طريق ماصته برفق فوق الراتنج. دع المحلول يستنزف تماما واستمر في تحميل المحلول.

كرر هذه العملية حتى تتم إضافة الحل بالكامل. سيكون الجزء العلوي من الراتنج بني غامق أو أسود. سوف ينخفض حجم الراتنج قليلا.

بعد ذلك ، قم بتغطية الجزء العلوي من الراتنج بخرز زجاجي لمنع إزعاج الراتنج عند إضافة محاليل جديدة. قم بتخطيب العمود ب 20 مل من حمض واحد من حمض الهيدروكلورايد الواحد. ثم قم بمسح العمود ب 50 مل من تركيز HCL المتزايد البالغ 1.5 مولار.

سيبدأ المحلول الأصفر في الخروج من العمود. بعد ذلك ، قم بزيادة تركيز HCL إلى اثنين من الملاريين واستمر في التصفية بمقدار 150 إلى 200 ملليلتر. سيبدأ الطلاء باللون الأصفر الباهت جدا ويذهب إلى اللون الأصفر الفاتح.

انتظر حتى يصبح الشطف القادم من العمود شاحبا جدا مرة أخرى. الصبر أمر بالغ الأهمية في هذه الخطوة. يجب أن يكون الطلاء شاحبا جدا.

زيادة تركيز حمض الهيدروكلوريك إلى 2.5 مولار. اجمع المشتعث ككسور في أنابيب الاختبار. أخيرا ، قم بزيادة التركيز إلى ثلاثة مولار HCL.

سوف يتخلص المنتج من العمود كمحلول أخضر بني. قد يبدأ الكسر الأحمر والبني أيضا في الخروج من العمود. هذه الكسور عبارة عن شوائب بنية الروثينيوم ولا ينبغي تجميعها مع الكسور الخضراء والبنية.

لاختبار جميع الكسور بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية والبصرية، أضف 100 ميكرولتر من جزء معين إلى ملليلترين من ثلاثة أمونيا مولية. ثم قم بتحليل الخليط عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. سيكون للكسور التي تحتوي على منتج نقي نطاق امتصاص كبير عند 360 نانومتر وامتصاص أقل كثافة عند 600 نانومتر.

يدل الامتصاص عند 480 نانومتر على اللون البني الروثينيوم والامتصاص عند 533 نانومتر يمثل شوائب الروثينيوم الحمراء. تظهر الشوائب الأخرى عند امتصاص أقل من 300 نانومتر. كسور تجمع تحتوي على منتج نقي وتبخر المحلول إلى الجفاف عن طريق التبخر الدوار قبل تحليل العينة في الحالة الصلبة بواسطة التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء.

تابع تقييم تثبيط امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا عن طريق التحليل الطيفي الفلوري كما هو مفصل في بروتوكول النص. تتميز أطياف UV-Vis من أنقاة عبر دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد بامتصاصات رئيسية وطفيفة عند 360 نانومتر و 600 نانومتر على التوالي. على العكس من ذلك ، يظهر الخليط غير النقي نطاقات امتصاص عند 533 نانومتر من الشوائب الحمراء الروثينيوم وعند 275 إلى 300 نانومتر من مادة البداية.

توصيف الحالة الصلبة باستخدام التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء له الامتدادات المتوقعة من الأمينات. بالإضافة إلى أكسجين الروثينيوم ، يمتد الروثينيوم عند 850 سم معكوس. تظهر خلايا HeLa المتنفذة المعالجة بصبغة فلورية حساسة للكالسيوم وعبر دياكوا أوكتو أمين مو-أوكسو ديروثينيوم خماسي كلوريد تثبيط امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا.

أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر السماح للكسور بالتآكل تماما. الصبر سينتج عنه منتج نقي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع وتنقية وتوصيف هذا التناظرية القوية من الروثينيوم 360.

تنظم مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا مجموعة واسعة من العمليات بين الخلايا بما في ذلك الطاقة الحيوية وموت الخلايا الخاضع للرصد. يمكن تطبيق المثبط الناتج عن هذه الطريقة في الدراسات لفهم دور بيولوجيا الكالسيوم في الميتوكوندريا في التوسط في العمليات البيولوجية الأخرى. لا تنس أن العمل مع الأحماض والقواعد المركزة يسبب التآكل ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.