الحمض النووي تلطيخ الأسلوب استناداً إلى هطول الأمطار Formazan الناجمة عن التعرض للضوء الأزرق
يناير 28, 2018
يسمح هذا الأسلوب تلطيخ انتقائية والتقدير الكمي للدنا في المواد الهلامية بامتصاص الجل في "أخضر سيبر" أنا/الحل "نيترو تيترازوليوم الأزرق" وثم يعرضها لأشعة الشمس أو مصدر ضوء أزرق. وهذا ينتج من ترسبات مرئية وتتطلب تقريبا أي معدات، مما يجعله مثاليا للاستخدام الميداني.
يتكون بروتوكول تلطيخ الحمض النووي من ثلاث خطوات عامة. الأول هو وضع الجل في محلول SYBR Green I و nitro blue tetrazolium ، المعروف أيضا باسم NBT. ثم يتم تقليب الجل لمدة 25 دقيقة إذا كان جل بولي أكريلاميد وساعة إذا كان جل الاغاروز.
الخطوة الأخيرة هي تعريض الجل لمصدر ضوء أزرق مثل مصابيح LED الزرقاء أو ضوء الشمس. خلال هذه الخطوة تظهر بعض النطاقات المترسبة. هذه النطاقات لها علاقة مباشرة بتركيز الحمض النووي ويمكن بعد ذلك رقمنة الجل في ماسح ضوئي مكتبي من أجل تحديد الحمض النووي.
بالنسبة لهلام بولي أكريلاميد ، يتم تحضير جل بولي أكريلاميد غير متغير للطبيعة. ثم يتم تحميل الجل بالعينات وتبدأ عملية الرحلان الكهربائي. يتم الآن تخفيف SYBR Green I إلى 1.2X ويتم الآن تحضير محاليل NBT 20 مللي مولار.
يتم وضع الجل في وعاء بلاستيكي ويضاف 16.75 مل من SYBR Green I المخفف و 325 مل من NBT عند 20 مللي مولار. ثم تغطى الحاوية بورق البارافيلم ورقائق الألومنيوم وتقلب عند 60 دورة في الدقيقة لمدة 25 دقيقة. أخيرا ، تتم إزالة رقائق الألومنيوم و Parafilm ويتعرض الجل لأشعة الشمس أو مصدر الضوء الأزرق.
لقياس منحنيات المعايرة والمعايرة للنطاق ، يتم وضع الجل في ماسح ضوئي مكتبي ، ثم يتم تحليل الصورة باستخدام برنامج تحليل الصور. أخيرا ، يتم إجراء طعم للإشارة الطبيعية مقابل التركيز. يتكون جل الاغاروز.
يتم تحميل الآبار ببلازميد يتمتع بمقاومة الأمبيسلين ويتم تقطيع الجل إلى قطعتين ، كل منهما ملطخ ببقعة مختلفة. ثم يتم استخراج شريط البلازميد وتحويله عن طريق التحول الكيميائي إلى خلايا مختصة بوسائط تحتوي على الأمبيسيلين. يتم تحضير هلام الاغاروز بنسبة 1٪ في المخزن المؤقت TAE 1X ويتم تحميله بأربعة ميكرولترات من البلازميد بحوالي 100 نانوغرام لكل ميكرولتر.
ثم يتم تشغيل الجل الموجود في غرفة الرحلان الكهربائي عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة. نصف الجل ملطخ بطريقة SYBR Green I و NBT والنصف الآخر بطريقة SYBR Green I UV. بالنسبة لهلام الاغاروز ، يتم تنفيذ طريقة SYBR Green I NBT باستخدام SBYR Green I بتركيز 1.2X و NBT عند 2 ملليمولار.
يتم وضع الجل في وعاء بلاستيكي ويتم تحجيم حجم المحلول لتغطية الجل ويمتد وقت التقليب إلى ساعة واحدة. بالنسبة للمواد الهلامية الاغاروز ، يتم تنفيذ طريقة SYBR Green I شائعة الاستخدام عن طريق تغطية الجل بمحلول 1X SYBR Green I والتقليب لمدة ساعة. ثم يتعرض الجل لمصباح الأشعة فوق البنفسجية لتصور الفرقة لمدة دقيقتين.
بمجرد تلطيخ الجل ، يتم قطع شريط البلازميد بمشرط واستخراج البلازميد باستخدام مجموعة استخراج تجارية. يتم تطبيع الحمض النووي إلى 9.1 نانوجرام لكل ميكرولتر لتحويل بكتيريا الإشريكية القولونية XL 10 المختصة كيميائيا. أخيرا ، يتم حساب المستعمرات.
يتم حساب وحدات تشكيل المستعمرة. يتم تطعيم النتيجة ومقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من SYBR Green I NBT و SYBR Green I UV. يظهر راسب فورمازان أرجواني حيث يوجد الحمض النووي.
في التجربة ، تم تحميل سلم الحمض النووي لعمل منحنى معايرة بحد اكتشاف يبلغ 192 بيكوغرام عند 1،500 زوج أساسي. يسمح استخدام المواد الهلامية الاغاروز باستعادة العينة باستخدام المجموعة المتوفرة تجاريا ولا يتداخل مع الاستخراج. ينتج عن بعض الاسترداد باستخدام هذه الطريقة مع LED الأزرق جودة أفضل مقارنة ب SYBR Green I باستخدام transilluminator.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تتيح هذه الطريقة صبغ الحمض النووي DNA وتقديره كمياً بشكل انتقائي في الهلامات باستخدام محلول SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium. وتتطلب هذه العملية حداً أدنى من المعدات، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات الميدانية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا الجزيئية
- التطبيقات الميدانية
خلفية علمية
- يعد تقدير كمية DNA أمراً أساسياً لمختلف الدراسات البيولوجية.
- غالباً ما تتطلب الطرق التقليدية معدات معقدة.
- تبسط هذه الطريقة العملية بشكل كبير.
- تستخدم كواشف شائعة لتحقيق نتائج فعالة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة بسيطة لصبغ الحمض النووي DNA.
- تمكين القياس الكمي للحمض النووي DNA في أنواع مختلفة من الهلام (gel).
- تسهيل العمل الميداني مع الحد الأدنى من متطلبات المعدات.
الطرق المستخدمة
- نقع الهلام في محلول SYBR Green I و NBT.
- تحريك الهلام لمدة 25 دقيقة (بولياكريلاميد) أو ساعة واحدة (أجاروز).
- تعريض الهلام لمصدر ضوء أزرق أو ضوء الشمس.
- رقمنة الهلام لتقدير كمية DNA.
النتائج الرئيسية
- ترتبط نطاقات الراسب المرئية بتركيز DNA.
- تم تحقيق تلوين فعال باستخدام حد أدنى من المعدات.
- يمكن قياس النتائج كمياً باستخدام الماسحات الضوئية المكتبية القياسية.
- تظهر الطريقة موثوقية في الظروف الميدانية.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة نهجاً عملياً لتقدير كمية DNA.
- تعد هذه الطريقة مناسبة لأنواع مختلفة من الهلام والتطبيقات الميدانية.
- تعزز من إمكانية وصول الباحثين في المواقع النائية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح طريقة صبغ الحمض النووي DNA هذه التصوير المباشر والتقدير الكمي للأحماض النووية دون الحاجة إلى معدات متخصصة، مما يدعم التحقق السريع من الأهداف في البيئات محدودة الموارد. ومن خلال إلغاء الاعتماد على أجهزة الإضاءة الخلفية بالأشعة فوق البنفسجية (UV transilluminators)، تقلل هذه الطريقة من المخاطر الأمنية والتعقيدات التشغيلية في سير عمل الاكتشاف المبكر. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية من خلال ارتباط إشارة الصبغة القابل للتكرار مع تركيز DNA، مما يسهل اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) في مسارات تحديد المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في أبحاث وتطوير الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح اختبار الفرضيات من خلال الارتباط المباشر بين كثافة راسب الفورمازان وتركيز DNA، مما يدعم تقييم مستوى ارتباط الهدف.
- القيمة التشغيلية: تعتمد على التحريك في درجة حرارة الغرفة والتعرض للضوء الأزرق، مما يغني عن بروتوكولات الأشعة فوق البنفسجية الخطرة ومعدات التصوير المتخصصة.
- القيمة التنبؤية: توفر مخرجات كمية متوافقة مع الماسحات الضوئية المكتبية، مما يسمح بالمقارنة السريعة لإنتاجية الحمض النووي عبر الظروف التجريبية المختلفة.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج نطاقات رواسب مرئية ومستقرة تعمل كمقاييس معيارية لتنسيقات فحص الأحماض النووية عالية الإنتاجية.
- قابلية التكرار: تضمن أوقات التحريك المحددة (25 دقيقة لبولي أكريلاميد، و60 دقيقة للأجاروز) وتركيزات الكواشف القابلة للتوسع توليد إشارات متسقة عبر الدفعات المختلفة.
- التوافق مع المنصات: تعمل مع كل من هلام الأجاروز وبولي أكريلاميد، مما يتيح التكامل السلس في سير عمل الفصل الكهربائي الحالي لتحليل المتغيرات أو البلازميد.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الترجمية: يدعم استعادة البلازميدات الوظيفية بعد الصبغ، كما يتضح من زيادة وحدات تشكيل المستعمرات مقارنة بالطرق المعتمدة على الأشعة فوق البنفسجية، مما يتيح التحقق الوظيفي في المراحل اللاحقة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتجنب تلف الحمض النووي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، مما يحافظ على سلامة العينة من أجل ربط دقيق بين النمط الجيني والنمط الظاهري في مقايسات الفحص المظهري.
- المنفعة قبل السريرية: يتيح التقدير الكمي القابل للتطبيق ميدانياً لبنى التعبير الجيني أو عيارات الفيروسات في النماذج قبل السريرية دون الحاجة إلى بنية تحتية مختبرية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من استخلاص الحمض النووي وصولاً إلى التحقق من صحة المقايسة الوظيفية، لا سيما في الحالات التي يكون فيها الوصول إلى المعدات محدوداً أو تتطلب العملية تكراراً سريعاً.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم التحقق من الأهداف من خلال توفير قراءات كمية للحمض النووي DNA تتناسب مع كفاءة النسخ أو التعديل في دراسات تعديل المسارات.
- الفحص: تتيح التحديد الكمي المعياري للأحماض النووية لتأكيد النتائج الإيجابية في مكتبات CRISPR أو مكتبات الإفراط في التعبير، مما يحسن من إمكانية تكرار المقايسة.
- التحليلات: تولد منحنيات خطية للعلاقة بين الإشارة والتركيز عبر التصوير باستخدام الماسح الضوئي المكتبي، مما يدعم تسوية البيانات عبر تنسيقات الأطباق متعددة الآبار أو التنسيقات القائمة على الهلام.
- الأبحاث الانتقالية: تسهل استعادة الأحماض النووية السليمة لإجراء المقايسات الوظيفية في المختبر in vitro، مما يربط مرحلة الاكتشاف باختبارات الفعالية قبل السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تتطلب فقط SYBR Green I وNBT ومصدر ضوء أزرق، مما يجعلها وحدة منخفضة التكلفة وقابلة لإعادة الاستخدام عبر فرق مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي عن طريق تجنب الشوائب الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية، مما يحسن موثوقية البيانات في فحوصات التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: يلغي الحاجة إلى الغرف المظلمة أو أجهزة الإضاءة عبرية النفاذ، مما يزيد من معدل الإنتاجية ويقلل من الاختناقات في المرافق المركزية المشتركة.
- القيمة الاستراتيجية: يخفض النفقات الرأسمالية لتقدير كمية الأحماض النووية، مما يتيح إجراء الاختبارات اللامركزية في المختبرات الفرعية أو مواقع التعاون.
- التأثير على المحفظة: يدعم التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال توفير تأكيد مبكر ومستقل عن المعدات لإنتاجية البناء الجزيئي قبل الاستثمار في عمليات التنقية اللاحقة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب تدريبًا أساسيًا في البيولوجيا الجزيئية لتحضير الهلام (gel) والترحيل الكهربائي.
- يتطلب الوصول إلى مصدر ضوء أزرق (مثل LEDs بطول موجي 470 nm) أو ضوء الشمس، بالإضافة إلى معدات التقليب المختبرية القياسية.
- يستلزم توحيد أوقات الصبغ وتركيزات الكواشف لضمان إمكانية تكرار النتائج بين المختبرات المختلفة.
- قد يتطلب تحسينًا ليتناسب مع تنسيقات الإنتاجية العالية نظرًا لخطوات التعامل اليدوي مع الهلام.
- يقتصر على الكشف عن الأحماض النووية؛ ولا ينطبق على مقايسات البروتينات أو الجزيئات الصغيرة دون إجراء تعديلات.
