اختبار التلألؤ البيولوجي ATP

اختبار التلألؤ الحيوي ATP تقنية شائعة تستخدم لتحديد مستويات ATP واكتشاف الخلايا الحية النشطة الأيضية. ATP أو أدينوسين ثلاثي الفوسفات هو المصدر الأساسي للطاقة لجميع الكائنات الحية ، ونعني ب "الكل" ALL. على المستوى الخلوي ، يتم إنشاء ATP من خلال مجموعة من عمليات التمثيل الغذائي تسمى التنفس الخلوي.

اليوم ، سنناقش بإيجاز المسارات التي ينطوي عليها التنفس الخلوي. بعد ذلك ، سنقدم المبادئ الكامنة وراء مقايسة التلألؤ البيولوجي ATP ، ونذهب من خلال بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ هذه الطريقة. أخيرا ، سنرى كيف يطبق العلماء هذه التقنية في أبحاثهم الحالية.

لنبدأ بإدخال التنفس الخلوي. تتضمن هذه الظاهرة العديد من عمليات التمثيل الغذائي ، لكننا سنركز على تلك التي تتعامل مع استقلاب الجلوكوز.

في السيتوبلازم ، يحول مسار تحلل السكر الجلوكوز إلى بيروفات ، وفي هذه العملية يولد جزيئين من ATP. يتم نقل البيروفات إلى الميتوكوندريا ، حيث يتم تحويله إلى أسيتيل إنزيم أ - وهي عملية تولد أيضا ثاني أكسيد الكربون. بينما لا يزال في الميتوكوندريا ، يدخل أسيتيل إنزيم أ في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل أو TCA ، حيث يتم إنشاء ثاني أكسيد الكربون مرة أخرى ، وكذلك جزيئات NADH و FADH2. هذه الجزيئات في النهاية "تحمل" الإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترون أو ETC.

داخل ETC ، يتم نقل الإلكترونات بالتتابع بين مجمعات البروتين المختلفة في غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، قبل تحويل الأكسجين إلى ماء. خلال هذه العملية ، يتم "ضخ" البروتونات في الفضاء بين الغشاء للميتوكوندريا. يتم إنتاج ATP في الواقع عندما تدخل هذه البروتونات مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا أثناء مرورها عبر بروتين يسمى سينسيز ATP. تؤدي دورة TCA و ETC معا إلى تخليق 36 جزيء ATP. يمكن أن يؤدي انهيار جزيئات المغذيات الأخرى ، مثل الدهون والبروتينات ، إلى تغذية دورة TCA و ETC ، مما يؤدي إلى إنتاج ATP.

الآن بعد أن عرفنا كيف تولد الخلايا ATP ، دعنا نتعرف على المبادئ الكامنة وراء مقايسة التلألؤ البيولوجي ATP ، والتي تستخدم بشكل شائع لقياس المستويات داخل الخلايا لهذا الجزيء.

من الناحية الهيكلية ، يحتوي ATP على قاعدة الأدينين ، وسكر الريبوز ، وثلاث مجموعات فوسفات - ترتبط الأخيرة بروابط عالية الطاقة. تطلق هذه الروابط الطاقة عند كسرها ، ويستفيد مقايسة التلألؤ البيولوجي ATP من هذه الطاقة.

في الأساس ، يتطلب هذا الاختبار مركب لوسيفيرين ، الذي يتم الحصول عليه من الكائنات الحية "المتوهجة" مثل اليراعات ، وإنزيم المحفز المقابل له المسمى لوسيفيراز. في وجود الأكسجين ، يستمد لوسيفيراز الطاقة من ATP ويحول لوسيفيرين إلى أوكسيلوسيفيرين. المنتجات الثانوية لهذا التفاعل هي البيروفوسفات ، وهو مجموعتان من الفوسفات تم الحصول عليهما من ATP - تحويله إلى أحادي فوسفات الأدينوزين أو AMP - ثاني أكسيد الكربون ، والضوء أو اللمعان. تتم قراءة اللمعان بواسطة مقياس الإضاءة ، وهو آلة تحدد انبعاث الضوء. نظرا لأن كمية التلألؤ الناتجة تتناسب طرديا مع كمية ATP ، فإن هذا يخدم مؤشرا جيدا على بقاء الخلية والتمثيل الغذائي.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء مقايسة التلألؤ البيولوجي ATP ، دعنا نحدد بروتوكولا عاما.

أولا ، يتم زرع الخلايا في صفيحة من 96 بئرا تحتوي على وسائط استزراع. يتم طلاء الخلايا بكثافات مختلفة في ثلاث نسخ ، لحساب التباين المعتمد على الكثافة. نظرا لأن الآبار الخارجية ليست محاطة بآبار أخرى من جميع الجوانب الأربعة ، فقد تكون درجة الحرارة ومعدل التبخر في هذه الآبار متغيرة. لذلك ، لا يتم طلاء الخلايا في الآبار الخارجية ، وبدلا من ذلك يتم ملؤها بالماء لتجنب التبخر على مستوى اللوحة وتغير درجة الحرارة الذي قد يؤثر على التفاعل. ثم يتم تحضين الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق بألواح الثقافة.

بعد ذلك ، تتم إزالة الوسائط ، ويضاف لوسيفيراز ولوسيفيرين إلى كل بئر ، وتوضع اللوحة على شاكر لمدة 5-15 دقيقة لتسهيل التفاعل. بعد ذلك ، يتم نقل جزء من الخليط من كل بئر إلى صفيحة بيضاء مكونة من 96 بئرا ؛ غالبا ما تستخدم الصفائح البيضاء لأنها تعكس الضوء لأعلى ، مما يسمح بقراءات تلألؤ أكثر دقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تجنب الفقاعات ، لأنها يمكن أن تتداخل مع التحليلات اللاحقة. نظرا لأن إشارة التلألؤ يمكن أن تنخفض بمرور الوقت ، تتم قراءة اللوحة في غضون 10-12 دقيقة على مقياس الإضواء.

لتحليل نتائج مقياس الإضاءة ، يتم حساب متوسط قيمة التلألؤ من الآبار بنفس كثافة الخلية. من خلال مقارنة بيانات التلألؤ التي تم جمعها بهذه الطريقة من كل من عينات التحكم الصحية والخلايا المعالجة ، يمكن للباحثين تقييم تأثيرات علاج معين على الجدوى والتمثيل الغذائي - على وجه التحديد من خلال البحث عن انخفاض اللمعان في المجموعة التجريبية.

الآن بعد أن رأيت كيفية إجراء اختبار التلألؤ البيولوجي ATP ، دعنا نناقش تطبيقاته البحثية.

يحاول العلماء دائما تطوير مضادات فيروسات جديدة لا تضر أو تقتل الخلايا المضيفة. في هذه الدراسة ، تم زرع خلايا الثدييات في صفيحة متعددة الآبار وأصيبت بفيروس معين. تمت إضافة مركبات مختلفة مضادة للفيروسات إلى هذه العينات ، وتم إنشاء منحنيات تركيز الاستجابة لحساب التركيز الفعال خمسين أو EC50. EC50 هو تركيز المركب الذي تكون فيه صلاحية الخلية 50 بالمائة. هذه معلمة شائعة الاستخدام لتقييم السمية الخلوية للمركب.

يمكن أن تعطي مستويات ATP أيضا أدلة حول نشاط الميتوكوندريا في ظل ظروف مختلفة. هنا ، تم إجراء اختبار التلألؤ البيولوجي ATP على مستحضرات الميتوكوندريا المشتقة من خلايا الكبد والعضلات القوارض ، مما ساعد الباحثين على تقييم مدى وظيفة الميتوكوندريا في الأنسجة الطبيعية. الأهم من ذلك ، يمكن تمديد هذا البروتوكول لتوفير طريقة لفحص وظيفة الميتوكوندريا في حالات المرض.

يستخدم العلماء أيضا هذا الاختبار للتحقيق في علاجات السرطان المحتملة في أنظمة in vivo. في هذا المثال ، تم تعديل الخلايا السرطانية البشرية للتعبير عن لوسيفيراز وحقنها في أدمغة الفئران الحية. بعد أن تنشأت الخلايا السرطانية في هذه ، تم علاجها بدواء مضاد للسرطان. كشف اختبار التلألؤ البيولوجي اللاحق في الجسم الحي ATP أن الخلايا السرطانية في الفئران المعرضة للأدوية لديها مستويات ATP أقل.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لمقايسة التلألؤ البيولوجي ATP. يجب أن تكون الآن على دراية بمسارات التنفس الخلوي والبروتوكول المستخدم لقياس ATP ، وهو المنتج النهائي لهذه المسارات. يعمل اختبار التلألؤ البيولوجي ATP كأداة فحص ممتازة لعلماء الأحياء الخلوية المهتمين بدراسة تأثير العوامل الفسيولوجية والمرضية على استقلاب الخلايا وقابليتها للحياة. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!