تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على خلايا كافية من العقدات الجذرية الظهرية والأعصاب الوركي من فأر فردي حتى تتمكن من إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن المواد العصبية الطرفية تولد كميات كبيرة من الحطام عند هضمها. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن استخدام العديد من العلامات في وقت واحد لتحديد أنواع الخلايا المتعددة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص الالتهاب وعلم الأمراض المناعية أثناء الاعتلال العصبي. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لنماذج الفئران ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الأخرى ، مثل أعصاب الإنسان والخنازير ، مع تعديلات طفيفة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الكميات الكبيرة من الحطام الناتج عن عملية الهضم.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تنفيذ خطوات التشريح وتفكك الخلايا لأن المادة العصبية لكل فأر محدودة. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما رأينا بروتوكولا يعزل خلية البجعة عن العصب الوركي من مختبر ستيف لاكروا. للبدء ، قم بإعداد الماوس كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب ووضعه على الجانب البطني لأسفل أثناء تمديد الأطراف السفلية.

بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط لتشريح الأعصاب الوركي بأكملها بشكل ثنائي. ابدأ بفصل الأنسجة العضلية عن الفخذ الظهري العلوي واتبع العصب لأعلى على طول العمود الفقري. اقطع العصب حيث يخرج من العمود الفقري وفوق الركبة مباشرة في الطرف الآخر.

ثم انقل الأعصاب المستقرة إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 1 مليلتر من PBS المثلج. قم بتخزين الأعصاب على الجليد. بعد ذلك ، اعزل عقدة الجذر الظهري.

ابدأ بقطع الأضلاع بالتوازي مع العمود الفقري وبالقرب منه على كلا الجانبين. ثم ، قم بقطع العمود الفقري بشكل عرضي على مستوى عظم الفخذ على الجانب الخلفي وبالقرب من الجمجمة على الجانب الأمامي. قم بإزالة العمود الفقري واستخدم مقص القزحية لقطع جميع العضلات والدهون والأنسجة الرخوة الأخرى من العمود الفقري.

بعد ذلك، ضع العمود الفقري بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى وافتحه بدءا من الطرف الذيلي، عن طريق تحريك طرف واحد من المقص في القناة الفقرية في موضع الساعة 12 وقص العظم. استمر حتى يتم قطع العمود الفقري بالكامل ، كرر هذا الإجراء في موضع الساعة السادسة حتى ينخفض العمود الفقري إلى النصف. افصل نصفي العمود الفقري ، ثم ضع العينة تحت مجهر التشريح.

قم بإزالة الحبل الشوكي لكشف الأعصاب الشوكية ، ثم حدد موقع وقم بإزالة العقدات الجذرية الظهرية القطنية عن طريق شد الجذر الظهري برفق لسحبه إلى القنوات الفقرية. بعد ذلك ، استخدم مقص القزحية لقص الأعصاب والأنسجة الضامة حول عقدة الجذر الظهري. باستخدام الملقط ، انقل العقدات الجذرية الظهرية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر وقم بتخزينها على الجليد.

لتحديد موقع العقدات الجذرية الظهرية ، واستخراجها دون إتلافها ، وتحريرها من العصب الشوكي ، يتطلب تمرينا ومهارة. قم بإعداد وسط الهضم ، واستكمله بمائة ميكروغرام لكل مليلتر من منقوص الأكسجين نوكلياز وقم بتخزينه على الثلج. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسائط الهضم في كل أنبوب من الأنابيب مع الأعصاب الوركي والعقدات الجذرية الظهرية.

بالنسبة للأعصاب الوركي ، قم بتقطيع المادة من 15 إلى 20 مرة باستخدام مقص زنبركي ، ثم احتضان معلقات الأنسجة في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع تحريض لطيف. بعد الحضانة ، قم بتعليق الخلايا بشكل متكرر من خلال طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لفصل أي أنسجة غير مهضومة ميكانيكيا. كرر عملية التخلي من خلال طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر.

ثم احتضان العينة لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية مع تحريض لطيف. قم بإعداد عازلة FACS المثلجة واستخدمها لشطف ونقع شاشة من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم شبكة 140 ميكرون في طبق بتري 60 ملم على الثلج. بعد ذلك ، استخدم ملقطا غير حاد لتثبيت مرشح الشاشة 140 ميكرون فوق طبق بتري وتمرير تعليق الأنسجة بشكل متكرر عبر الفلتر.

اجمع معلق الخلية من طبق بتري وانقله إلى نفس أنبوب 1.5 مليلتر المخزن على الجليد. ادفع أي أنسجة غير مهضومة بالكامل متبقية على الفلتر عن طريق التجربة المتكررة بطرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر. بعد ذلك ، اشطف مرشح الشاشة مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وادمجه مع تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر.

إذا تم هضم الكثير من العينة بشكل غير كامل وتمريرها عبر الشبكة المعدنية ، فقد يحدث فقدان الخلية وقد يكون تحليل قياس التدفق الخلوي مستحيلا. الطرد المركزي معلقات الخلية والتخلص من المادة الطافية. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية في مليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS.

كرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في 150 إلى 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. الخلايا جاهزة الآن للتلطيخ. في الكمبيوتر ، حدد القنوات المناسبة للكشف عن الفلوروفورات ذات الأهمية ، ومعدل التدفق المناسب للعينات ، والعدد الإجمالي للأحداث التي سيتم جمعها لكل عينة.

يجب أن يكون الحد الأدنى لعدد الأحداث مليونا. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخططات مبعثرة ضمن ورقة عمل عالمية للمبعثر الجانبي A مقابل Forward Scatter A وكذلك لكل فلوروفور ذي أهمية مقابل Forward Scatter A. أيضا ، قم بإنشاء طريقة عرض إحصائية تعرض عدد الأحداث ومتوسط شدة الفلورسنت للفلوروفورات المحددة. حدد البوابة الأصلية، P1، استنادا إلى مخطط التبعثر من عناصر تحكم تلطيخ DAPI فقط.

قم بإرفاق العينة بقياس التدفق الخلوي وانقر فوق الحصول عليها. راقب مخطط DAPI مقابل FSC وقلل جهد القناة الزرقاء للحمض النووي والمحيط الهادئ حتى يصبح السكان DAPI + مرئيا. باستخدام أداة البوابة المستطيلة، ارسم مربعا حول مجموعة DAPI+.

هذا يمثل بوابة P1. حدد مخططات التبعثر لكل من الفلوروفورات واعرض أحداث DAPI+فقط يمثل هذا مضان الخلفية لكل من الفلوروفورات.

باستخدام بوابة المستطيل أيضا ، ارسم مربعا في مخططات المبعثر لكل من الفلوروفورات ، بدءا من 103 على المحور y. تمثل هذه البوابة المنطقة التي يجب أن توجد فيها الأحداث الإيجابية لكل علامة من العلامات المذكورة. اضبط الفولتية لكل من الفلوروفورات باستخدام أدوات التحكم في تلطيخ DAPI فقط.

قم بإرفاق العينة بقياس التدفق الخلوي وانقر فوق الحصول عليها. راقب موضع DAPI + السكان لكل من الفلوروفورات واضبط الفولتية المعنية بحيث تقع السكان خارج البوابة المستطيلة. بمجرد إعداد مقياس التدفق الخلوي ، قم بتشغيل العينات وتصدير ملفات Forward Scatter لمزيد من التحليل.

غسل صبغة DAPI قبل التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي إلى تقليل كثافة الفلورسنت للحطام غير النواة. سمح ذلك باستبعاد المواد الموجودة على الطرف العلوي من محور التشتت الأمامي ، والتي تحتوي على أنسجة مهضومة بشكل غير كامل ، في اختيار السكان المفردين. بشكل عام ، يمكن الحصول على أكثر من 30،000 فردية بانتظام من اثنين من الأعصاب الوركي الكاملة ويمكن الحصول على أكثر من 200،000 فردية من العقدات الجذرية الظهرية.

من الأعصاب الوركي ، عبر ما يقرب من 5٪ من المفردات عن CD45 على سطحها ، بينما تم العثور على ما يقرب من 5٪ إلى 10٪ للتعبير عنها في العقدات الجذرية الظهرية وبالتالي تعريف هذه الخلايا على أنها كريات البيض من أصل مكونة للدم. عبرت غالبية المفردات الإيجابية CD45 أيضا عن معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية بطريقة تدريجية. في العقدات الجذرية الظهرية ، يمكن استخدام CD11b للكشف عن الخلايا الشبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة ، ومع ذلك. هذه المجموعة الدبقية الصغيرة غائبة عن الأعصاب الوركي.

في العصب الوركي والعقدة الجذرية الظهرية ، عبر 2٪ إلى 5٪ من المفردات عن CD68. في الأعصاب الوركي ، عبر ما يقرب من 60٪ 80٪ من البلاعم الإيجابية CD68 عن CD206. في حين أن نسبة أقل من CD68 إيجابي مشترك في التعبير عن CD206 في عقدة الجذر الظهري.

أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة لضمان نتيجة ثابتة. بعد تطويرها ، سمحت هذه التقنية للباحثين في مجال مرض السكري باستكشاف الآثار السامة للستربتوزوتوسين المستخدم للحث على مرض السكري في الفئران. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء قياس التدفق الخلوي على الأنسجة العصبية المحيطية.

لا تنس أن العمل مع بارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ونظارات السلامة.