What are reactive oxygen species and how do they form in cells?

Reactive oxygen species (ROS) are chemically active, oxygen-derived molecules with unpaired electrons that make them unstable. They form primarily in mitochondria when electrons leak during cell metabolism and the electron transport chain. The addition of one unpaired electron to stable dioxygen creates the superoxide anion, the initial ROS form, which then generates other reactive species like hydrogen peroxide and hydroxyl radicals.

How does oxidative stress damage cells and what are its consequences?

Oxidative stress occurs when ROS levels exceed the cell's antioxidant defense capacity, creating a positive feedback loop of damage. These highly reactive molecules oxidatively damage cell membranes, DNA, and proteins. Excessive ROS has been implicated in cancer initiation and progression, and induces cellular senescence, supporting the Free Radical Theory of Aging that links ROS to cellular aging and death.

What beneficial roles do reactive oxygen species play in cells?

Beyond their harmful effects, ROS serve important physiological functions. During immune responses, phagocytes generate excessive ROS in a respiratory burst to oxidatively degrade pathogens. ROS also act as necessary intermediates and regulators in various cell signaling pathways and can signal the death of cancerous cells, making them essential mediators of cellular defense and communication.

How does the H2DCFDA fluorescent probe detect reactive oxygen species?

H2DCFDA is a non-fluorescent probe that passively diffuses into cells. Intracellular esterases cleave its acetate groups, making it polar and retained within the cell. Upon oxidation by ROS, the hydrogen atoms are removed, converting non-fluorescent H2DCFDA into highly fluorescent dichloro-fluorescein (DCF), which can be quantified using plate readers, flow cytometers, or fluorescence microscopy.

What steps are involved in performing an ROS detection assay?

The protocol begins by transferring cultured cells to phosphate buffered saline and centrifuging to wash them. Add H2DCFDA probe solution and incubate cells in the dark to prevent photobleaching. After incubation, wash cells to remove unloaded dye and transfer to a plate. Add oxidative stress inducers as needed, then analyze using a plate reader set to fluorescein excitation and emission wavelengths.

How are scientists using ROS detection to study immune responses and disease?

Researchers employ ROS detection to investigate phagocytosis and immune development. In one study, zebrafish treated with NADPH inducers showed higher ROS at 72 hours post-fertilization than at 48 hours, revealing developmental differences in immune response. Additionally, scientists measure ROS levels in neurons and astrocytes to identify mitochondrial dysfunction and assess how astrocytes protect central nervous system neurons from oxidative stress.

Why is measuring ROS important for understanding cell metabolism and disease?

ROS levels reflect the balance between electron transport during cell metabolism and antioxidant defenses. Measuring ROS provides insight into cell metabolism metabolic pathways and assays, revealing how metabolic activity generates oxidative stress. Since mitochondrial dysfunction and excessive ROS are pathological features of many diseases including cancer and neurodegeneration, reliable ROS quantification is invaluable for disease research and understanding cellular health.

الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية

0 مشاهدة09:08 دقيقة

تورطت أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة في الخلايا في توازن الأنسجة والشيخوخة الخلوية والحالات المرضية مثل السرطان. كما يوحي اسمها ، تنشأ هذه الجزيئات من الأكسجين ، الذي يوجد بشكل طبيعي كجزيء ثابت ثنائي الأكسجين حيث يتم إقران جميع إلكتروناته. إن إضافة إلكترون واحد غير متزاوج يجعله غير مستقر ، ويؤدي إلى تكوين أنيون الأكسيد الفائق - وهو شكل من أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS. بخلاف أنيون الأكسيد الفائق ، هناك عدة أنواع من الأنواع التفاعلية ذات الإلكترونات غير المزاوجة ، والتي تهدف الخلية إلى التحكم في مستوياتها بإحكام.

في هذا الفيديو، سوف نتعرف على مدى ارتباط أنواع الأكسجين التفاعلية بعملية التمثيل الغذائي للخلايا ومرضها، وسنستكشف المبادئ الكامنة وراء المقايسة للكشف عنها باستخدام مسبار الفلورسنت، وسنتناول بروتوكولا معمما لهذا المقياس. أخيرا ، سنحقق في كيفية تنفيذ العلماء لهذه الطريقة في التجارب اليوم.

أولا ، دعنا نناقش كيفية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، ونأخذ في الاعتبار تأثيرها في استقلاب الخلايا وأمراضها.

مصدر مهم لأنواع الأكسجين الخلوي التفاعلي هو الميتوكوندريا. عادة ، أثناء عملية التمثيل الغذائي للخلية ، يتم نقل الإلكترونات عبر سلسلة من مجمعات البروتين ، وتبلغ ذروتها في تقليل الأكسجين الجزيئي إلى الماء والتوليد المتزامن ل ATP. على الرغم من التنظيم الاستثنائي لهذه العملية ، تتسرب الإلكترونات ، مما يؤدي إلى تكوين أنيون فائق الأكسيد.

يؤدي وجود أنيون الأكسيد الفائق بسرعة إلى ظهور أشكال أخرى من أنواع الأكسجين التفاعلية ، مثل بيروكسيد الهيدروجين وجذور الهيدروكسيل. هذه الجذور ، التي تمتلك جميعها إلكترونا غير متزاوج عالي التفاعل ، يمكن أن تلحق الضرر بالتأكسد بالأغشية والحمض النووي والبروتينات. للمواجهة ، تحتفظ الخلية بمخزونها المضاد للأكسدة من الإنزيمات مثل ديسموتاز الفائق ، أو جزيئات مثل فيتامين سي ، التي تقلل من الجذور الحرة. يمكن أن يؤدي أي خلل في نظام الدفاع هذا إلى حلقة تغذية مرتدة إيجابية قاتلة ، مما يؤدي إلى حالة من أنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة المعروفة باسم الإجهاد التأكسدي.

تورطت أنواع الأكسجين التفاعلية في بدء السرطان وتطوره. تأثير ضار آخر لهذه الجزيئات هو تحريض الشيخوخة الخلوية ، المعروف أيضا باسم الشيخوخة. تقترح "نظرية الجذور الحرة للشيخوخة" أن أنواع الأكسجين التفاعلية المنتجة في الخلايا أثناء التمثيل الغذائي الطبيعي تثير الشيخوخة الخلوية والموت.

حتى الآن ، ناقشنا الجوانب السلبية لهذه الجزيئات شديدة التفاعل ، لكن لها أدوارا إيجابية في علم وظائف الأعضاء الخلوي أيضا. أثناء الاستجابات المناعية عندما تبتلع الخلايا البلعمية مسببات الأمراض ، تقوم الخلايا بتركيب "انفجار تنفسي" يتم خلاله توليد كميات زائدة من أنواع الأكسجين التفاعلية لتحلل مسببات الأمراض بشكل مؤكسدي. بالإضافة إلى ذلك ، فهي وسيطة ومنظمة ضرورية لمجموعة متنوعة من مسارات إشارات الخلايا ، ويمكن أن تشير إلى موت الخلايا التي تحولت إلى سرطانية.

لتحديد هذه المؤكسدات الخلوية المؤثرة ، يستغل العلماء الجزيئات التي تتحول عند الأكسدة إلى الفلورسنت. المسبار الشائع الاستخدام للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية هو H₂ DCFDA أو ثنائي كلورو ثنائي هيدرو فلوريسين ثنائي الأسيتات ، وهو نظير غير فلوري للفلورسين. عند إضافتها إلى الخلايا ، تسمح طبيعتها الخلوية بالانتشار بشكل سلبي.

بعد ذلك ، تحفز الاستيرازات داخل الخلايا تفاعل التحلل المائي ، مما يؤدي إلى انشقاق مجموعات الأسيتات. هذا يجعل المركب أكثر قطبية ، بحيث يتم الاحتفاظ به داخل الخلية. عند الأكسدة ، والتي تتضمن إزالة ذرات الهيدروجين بواسطة مجموعة واسعة من أنواع الأكسجين التفاعلية ، يتم تحويل H2DCFDA غير الفلورية إلى ثنائي كلورو فلورسين عالي الفلورسنت ، أو DCF. يمكن قراءة ذلك وقياسه كميا بواسطة قارئ اللوحة أو مقياس التدفق الخلوي أو المجهر الفلوري.

الآن بعد أن عرفت كيف يعمل هذا الاختبار ، دعنا نرى كيف يتم إجراؤه في بيئة معملية.

ابدأ بنقل الخلايا المزروعة في وسط المزرعة إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، متبوعا بالطرد المركزي لغسلها. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف مسبار الفلورسنت H₂ محلول DCFDA. احتضان الخلايا المحملة بالصبغة في الظلام لمنع التبييض الضوئي. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا لإزالة الصبغة غير المحملة ونقل الخلايا إلى طبق. في هذه المرحلة ، يمكن إضافة محفزات الإجهاد التأكسدي التجريبية.

عندما تكون جاهزا للتحليل ، يمكن إدخال الخلايا في قارئ اللوحة. يتم ضبط الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للفلورسين. بعد قراءة اللوحات ، يمكن تحليل القيم. تكشف النتائج عن الكمية النسبية لأنواع الأكسجين التفاعلية بين العينات في نقاط زمنية معينة.

الآن بعد أن درسنا البروتوكول الفعلي ، دعونا نلقي نظرة على كيفية تطبيقه في التجارب اليوم.

غالبا ما يستخدم الباحثون هذه الطريقة للتحقيق في آليات البلعمة. أرادت هذه المجموعة من العلماء دراسة قدرة أسماك الزرد على تكوين استجابة مناعية في مراحل مختلفة من التطور. كما ذكرنا سابقا ، ينتج عن البلعمة توليد أنواع الأكسجين عالية التفاعل ، أو "انفجار الجهاز التنفسي" ، الذي يستخدم لقتل مسببات الأمراض. نظرا لأن إنزيم NADPH oxidase هو منتج مهم ل ROS في الخلايا البلعمية ، فقد قام هؤلاء العلماء بتحفيز استجابة الانفجار عن طريق معالجة أسماك الزرد بمحفز NADPH. أظهرت النتائج أنه من بين أجنة أسماك الزرد التي أثارت استجابتها "المتفجرة" ، أظهرت تلك التي بعد 72 ساعة من الإخصاب تطورا أعلى لأنواع الأكسجين التفاعلية من تلك التي كانت بعد 48 ساعة من الإخصاب.

يعد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا بسبب زيادة أنواع الأكسجين التفاعلية سمة مرضية للعديد من الأمراض. لذلك ، يمكن للباحثين تحديد الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا عن طريق قياس مستوى الإجهاد التأكسدي. هنا ، قام العلماء بتحميل H2DCFDA على الخلايا العصبية ، ثم قاموا بتركيب العينات على مجهر فلوري. عند إضافة مادة الضغط التأكسدي ، مثل بيروكسيد الهيدروجين ، أظهرت أجسام الخلايا زيادة مفاجئة في التألق ، والتي يمكن أن تكون مؤشرا على خلل في الميتوكوندريا.

تم اقتراح الخلايا النجمية لحماية الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي من الإجهاد التأكسدي. بسبب هذه الأهمية ، كان هؤلاء الباحثون يهدفون إلى تطوير اختبار للكشف عن الإجهاد التأكسدي في الخلايا النجمية في وجود محفز خارجي. لقد فعلوا ذلك عن طريق احتضان الخلايا النجمية ببيروكسيد الهيدروجين ومسبار الفلورسنت للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية. تم تحليل التألق اللاحق المتولد باستخدام مقياس التدفق الخلوي. لوحظ أن الخلايا النجمية التي تم تنشيطها للإجهاد التأكسدي تقع ضمن منطقة ذات كثافة مضان متزايدة ، شوهدت تحولت إلى اليمين.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS. باختصار ، ناقشنا في هذا الفيديو العلاقة بين أنواع الأكسجين التفاعلية ، والتمثيل الغذائي للخلايا ، والمرض. ثم قمنا بفحص مبدأ وإجراء الاختبار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية. أخيرا ، استكشفنا كيف يطبق الباحثون هذه الطريقة على تحقيقاتهم. إن تحليل الأدوار التي لا تزال غامضة لأنواع الأكسجين التفاعلية له أهمية كبيرة لعلماء الأحياء الخلوية ، وقد أثبت القياس الموثوق به باستخدام مجسات الفلورسنت أنه لا يقدر بثمن. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

أنواع الأكسجين التفاعلية هي جزيئات نشطة كيميائيا مشتقة من الأكسجين قادرة على أكسدة الجزيئات الأخرى. بسبب طبيعتها التفاعلية ، هناك العديد من الآثار الض…