في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي

وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة "المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.

الهدف العام لبروتوكول زراعة الخلايا المعدل هذا هو توفير تقييم النمط الظاهري السريع للتباين الأليلي في مرض فابري وبومبي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض التخزين الليزوزومي ، مثل النتائج التنبؤية والقرارات العلاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وأنها يمكن أن تساعد في تطوير أدوية جديدة ، مثل مرافقي الأدوية.

لتنفيذ الطفرات الموجهة للموقع ، ابدأ باستخدام التسلسلات المرجعية NM 00169.2 و NM 00152.4 كقوالب للطفرات في جينات GLA و GAA ، على التوالي. استخدم أداة Primer Design المجانية لدعم تصميم التمهيدي. بعد ذلك ، احصل على مجموعة من البادئات عالية النقاء والخالية من الملح التي تم تصنيعها بواسطة مزود تجاري ، مع بادئات الإحساس والمضادة للمعنى تحمل أحد تعديلات التسلسل المعنية ، المركزية لطولها ، لإدخال الطفرة بشكل فردي.

قم بإعداد خليط التفاعل بحجم 50 ميكرولتر وقم بتشغيل برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الشروط القياسية التي توفرها الشركة المصنعة وكما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد Dpn1 واستمر في احتضان قوارير التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد تحويل الحمض النووي للبلازما إلى خلايا بكتريا قولونية مختصة وإعداد البلازميدات للتحويل المطلوب وفقا لبروتوكول النص ، استخدم أداة بيولوجيا جزيئية مناسبة لتحليل التسلسل.

عند اكتشاف الطفرة المرغوبة وعدم وجود أي خلل آخر في التسلسل مقارنة ب NM 000169.2 ل alpha-galactosidase A أو NM 000152.4 لحمض alpha-galactosidase ، حدد الاستنساخ لتنقية البلازميد من الدرجة الانتقالية. تحديد نقاء الحمض النووي عن طريق قياس الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي. بعد زراعة الخلايا HEK293H في قارورة ثقافة T75 وفقا لبروتوكول النص ، قبل 24 ساعة من التعدي ، استخدم PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم لغسل الخلايا مرة واحدة.

باستخدام 0.05٪ Trypsin-EDTA ، قم بحصاد الخلايا وفي تجاويف صفيحة استزراع 24 بئرا استخدم 500 ميكرولتر من DMEM مكملة ب 10٪ FBS لبذر 1.5 في 10 في الخلايا الخمس. قم بإجراء تعداء الخلية وفقا لدليل الشركة المصنعة. باستخدام خليط من ميكروغرام واحد من الحمض النووي البلازميد المذاب في 100 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل و 2.5 ميكرولتر من كاشف التعداد.

احتضن المحلول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم أضفه إلى الخلايا بطريقة متساقطة. بعد فترة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على كاشف التعدي وأضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين. كخيار خلال هذه الخطوة ، أضف DGJ أو DNJ إلى وسيط الثقافة في المكان المقصود.

في يوم الحصاد ، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة. ثم استنشق الوسط واستخدم PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لغسل الخلايا بعناية مرتين. هذه الخطوة مهمة لأن DGJ و DNJ مثبطان لكلا الإنزيمين ، وبالتالي فإن أي متبقي من شأنه إبطال الاختبار.

بعد الغسيل ، أضف 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مباشرة فوق الخلايا. ثم شطف الخلايا من اللوحة ونقلها إلى أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر. ضع العينات في رف رغوي مناسب وقم بدوارها لمدة خمس ثوان لجعل التحلل أكثر كفاءة.

ثم قم بتبديل العينات بين النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان وحمام مائي بدرجة حرارة الغرفة حتى يكتمل الذوبان. بعد تكرار إجراء التجانس خمس مرات ، قم بتدوير العينات لمدة خمس دقائق عند 10 ، 000 جرام. ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب تفاعل جديد.

لإجراء اختبار BCA ، قم بإعداد أنبوب جديد لكل عينة تحتوي على 40 ميكرولتر من H20 منزوع الأيونات وأضف 10 ميكرولتر من العينة. امزج كل محلول عن طريق الدوامة لفترة وجيزة ونقل 10 ميكرولتر من كل عينة في ثلاث نسخ في تجاويف صفيحة 96 بئرا. لتحضير منحنى قياسي ، قم بتخفيف محلول مخزون BSA بمقدار 2 ملليغرام لكل مليلتر و H2O منزوع الأيونات وفقا لبروتوكول النص.

بعد الجمع بين الكاشف A والكاشف B ، ابدأ التفاعل بإضافة 200 ميكرولتر من محلول كاشف BCA واحتضان العينات في الظلام عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة على شاكر مداري لمدة ساعة واحدة. ثم قم بقياس الامتصاص عند 560 نانومتر في قارئ اللوحة. تحتوي العينات عادة على ما بين واحد و 1.5 ميكروغرام من البروتين لكل ميكرولتر.

بتخفيف الكمية المحسوبة لكل عينة وقم بتقطيعها إلى أنابيب تفاعل جديدة سعة 1.5 ملليلتر للحصول على 0.05 ميكروغرام من ألفا جالاكتوزيداز أ أو 0.5 ميكروغرام من حمض ألفا جلوكوزيداز لكل ميكرولتر من المحلول. قم بتدوير العينات لمدة خمس ثوان مرة أخرى وقم بتقطيع 10 ميكرولترات من هذا التخفيف في طبق مكون من 96 بئرا. ابدأ التفاعلات بإضافة 20 ميكرولتر من محلول الركيزة المعني.

بالنسبة إلى alpha-galactosidase A ، أضف اثنين من المليمولار 4-methylumbelliferyl alpha-D galactopyranoside ، أو 4-MU-gal ، في 0.06 مولي فوسفات سترات عازلة ، درجة الحموضة 4.7. بالنسبة لحمض ألفا جلوكوزيديز ، أضف 2 مللي مولار 4-methylumbelliferyl alpha-D glucopyranoside ، أو 4-MU-glou ، في 0.025 مولي أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 4.0. احتضان تفاعلات الإنزيم لمدة ساعة واحدة في الظلام عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة على شاكر مداري.

ثم قم بإنهاء التفاعل بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهيدروكسيد الصوديوم والجليسين 1.0 مولاري 10.5. قم بإعداد منحنى قياسي قدره 4-MU من مخزون 0.01 ملليغرام لكل مليلتر وفقا لبروتوكول النص وقم بتقطيع 10 ميكرولترات من المحاليل في شكل مكررات في لوحة سعة 96 بئرا. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1.0 مولي جلايسين الصوديوم وهيدروكسيد إلى كل بئر لضبط الحجم ودرجة الحموضة.

أخيرا ، قم بقياس نشاط الإنزيم في قارئ الإزهار المجهز بمجموعة المرشحات المناسبة. وتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لجهاز قارئ الفلورة. لتقييم كفاءة طفرات جين GLA ، تم تصنيف الطفرات إلى ثلاث فئات وكشفت أنه تم الحصول على حوالي 66.5٪ في المحاولة الأولى.

يمكن الحصول على 25٪ أخرى بعد تعديل طفيف في تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. في الفئة الثالثة ، كان لا بد من بذل المزيد من الجهد ، مثل إعادة تصميم التمهيدي ، لإنتاج الاستنساخ المطلوب. يشير هذا الجدول إلى نتائج قياس نشاط الإنزيم لثلاث طفرات ألفا جالاكتوزيداز أ وثلاث طفرات حمض ألفا جلوكوزيداز إما تركت دون علاج أو معالجة باستخدام DGJ و DNJ.

يتم عرض البيانات كقيم مطلقة لدوران الركيزة ولها قيم نسبية طبيعية للإنزيم من النوع البري. تم تصحيح بيانات نشاط الإنزيم المطلق لنشاط الإنزيم الداخلي للخلايا HEK293H باستخدام الخلايا المنقولة بناقل PCDNA 3.1 فارغ. تم تطبيع قيم نشاط الإنزيم إلى إنزيم من النوع البري من التجارب المقابلة ، وهو ما يفسر انحراف القيم النسبية بين الطفرات المختلفة.

بمجرد إتقان ، يمكن إجراء جزء ما بعد زراعة الخلية من هذه التجربة ، والذي يمثل معظم الوقت العملي ، في غضون أربع ساعات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض التخزين الليزوزومي لاستكشاف ارتباطات النمط الجيني والنمط الظاهري في مرض فابري وبومبي. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في تطوير أدوية جديدة في أمراض التخزين الليزوزومي.