المتزامن لرسم الخرائط وكوانتيتاتيون من ريبونوكليوتيديس في الحمض النووي البشري

الهدف العام من هذه التجربة هو رسم خريطة لموقع الريبونوكليوتيدات المدمجة عند مستوى دقة النيوكليوتيدات المفردة ، وتحديد عدد النيوكليوتيدات الريبونوكليوتيدات الموجودة في الحمض النووي للميتوكوندريا البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بسلامة الحمض النووي ، وآليات تكرار الحمض النووي ، وآليات إصلاح الحمض النووي ، وكيف تسبب العيوب في أي من هذه الآليات المرض. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن تحديد موقع وعدد الريبونوكليوتيدات المدمجة في الحمض النووي للميتوكوندريا في تجربة واحدة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمحتوى الريبونوكليوتيدات في الحمض النووي للميتوكوندريا البشري ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها لدراسة الحمض النووي النووي ومحتوى الريبونوكليوتيدات في جينومات التسلسل للكائنات الحية النموذجية الأخرى. يتم استخدام الحمض النووي الجيني المعزول مسبقا من خلايا HeLa والموصوف في القسمين الثاني والثالث من بروتوكول النص في هذه التجربة. لهضم الحمض النووي ، امزج ما يلي بعناية في أنبوب ميكروفوج.

ميكروغرام واحد من الحمض النووي ، وخمسة ميكرولترات من 10X Buffer 3.1 ، وميكرولتر واحد من HincII ، وماء خال من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 50 ميكرولترا. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عند اكتمال الملخص، أضف 1.8 حجما من الخرزات المغناطيسية إلى كل عينة، وتخلط بعناية عن طريق سحب العينات، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة خمس دقائق لحبيبات الخرز ، ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. اغسل الحبيبات ب 150 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية تقريبا ، ثم قم بإزالة المادة الطافية وتخلص منها. كرر الغسيل مع 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول لمدة 30 ثانية أخرى.

جفف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنابيب من الرف المغناطيسي. قم بتخطيب كل حبيبات في 45 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف ، وخلطها عن طريق سحب العينة بعناية ، واحتضانها لمدة خمس دقائق.

حبيبات الخرز على الرف المغناطيسي ، وانقل 45 ميكرولترا من كل عينة من الحمض النووي إلى أنبوب جديد. لكل 45 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول أو المنقى ، أضف خمسة ميكرولترات من ثلاثة هيدروكسيد بوتاسيوم مولار أو خمسة ميكرولترات من ثلاثة كلوريد بوتاسيوم مولي ، مما ينتج عنه حجم إجمالي قدره 50 ميكرولترا. يتم تلخيص ردود الفعل الثمانية في هذا الجدول.

احتضن في فرن تهجين على حرارة 55 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم احتضن العينات على الجليد لمدة خمس دقائق. قم بترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار عند درجة الحموضة 5.2 ، و 125 ميكرولتر من البرد ، 100٪ الإيثانول واحتضانها على الجليد لمدة خمس دقائق. حبيبات الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 21,000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

تخلص من المادة الطافية واغسل كل حبيبات الحمض النووي ب 250 ميكرولتر من البرد ، و 70٪ من الإيثانول ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى ، وتخلص من المادة الطافية. اترك الحبيبات تجف في الأنبوب المفتوح لمدة خمس إلى 10 دقائق, حتى يتبخر أي سائل مرئي. أخيرا ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الشطف ، واترك حبيبات الحمض النووي تذوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد مزيج التفاعل لكل عينة كمزيج رئيسي. لكل عينة ، أضف 2.5 ميكرولتر من 10x T4 محلول تفاعل كيناز عديد النوكليوتيدات T4 ، و 2.5 ميكرولتر من ATP ، وميكرولتر واحد من ثلاثة فوسفاتيز أولي ناقص T4 عديد النوكليوتيدات كيناز. انقل 19 ميكرولترا من كل عينة من الحمض النووي إلى أنبوب جديد سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتغيير طبيعته عند 85 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك ، قم بتبريد عينات الحمض النووي على الجليد ، وأضف ستة ميكرولترات من مزيج التفاعل المحضر إلى كل عينة. احتضان خلطات التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، متبوعة ب 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإيقاف التفاعل. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي ، كما هو موضح سابقا ، ولكن قم بالتخلص منه ب 14 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف.

قم بإعداد مزيج التفاعل كمزيج رئيسي مسبقا ، يحتوي على ما يلي لكل عينة. خمسة ميكرولترات من 10x T4 RNA ligase regas buffer ، وخمسة ميكرولتر من كلوريد hexamminecobalt (III) ، و 0.5 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد ARC140 ، و 0.5 ميكرولتر من ATP ، و 25 ميكرولتر من 50٪ PEG 8000. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات.

انقل 13 ميكرولترا من كل حمض نووي منقى إلى أنبوب جديد سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتغيير طبيعته عند 85 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة ثلاث دقائق. قم بتبريد الحمض النووي على الجليد ، ثم أضف 36 ميكرولترا من مزيج التفاعل إلى كل عينة ، واخلطه عن طريق سحب العينات ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة. أضف ميكرولتر واحدا من T4 RNA ligase إلى كل تفاعل ، واخلطه عن طريق سحب العينات ، ثم قم بالتدوير لفترة وجيزة.

احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام طوال الليل. عند اكتمال ربط الحمض النووي أحادي الخيط ، قم بتنقية الحمض النووي كما هو موضح سابقا ، ولكن استخدم 0.8 حجما من الخرز المغناطيسي وحبيبات الخرز لمدة 10 دقائق. قم بتقطيع 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف ، وانقل 20 ميكرولترا من كل عينة من الحمض النووي إلى أنبوب جديد سعة 200 ميكرولتر.

كرر التنقية ب 0.8 حجم من الخرز المغناطيسي ، وقم بإزالته في 14 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف. لكل عينة ، قم بإعداد مزيج التفاعل كمزيج رئيسي يتكون من ميكرولترين من محلول تفاعل بوليميراز 10x T7 DNA ، وميكرولترين من ARC76 / 77 ، وميكرولترين من dNTPs ، و 0.8 ميكرولتر من BSA. انقل 12.8 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى إلى أنبوب جديد سعة 200 ميكرولتر ، وقم بتغيير طبيعة طبيعته عند 85 درجة مئوية في جهاز تدوير حراري لمدة ثلاث دقائق.

قم بتبريد الحمض النووي على الجليد ، ثم أضف 6.8 ميكرولتر من مزيج التفاعل إلى كل عينة ، واخلطه عن طريق سحب العينة ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أضف 0.4 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي T7 إلى كل تفاعل ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد تنقية الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي ، قم بشطف 11 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف.

لبدء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد مزيج التفاعل بشكل منفصل لكل عينة في أنبوب جديد سعة 200 ميكرولتر يتكون من 7.5 ميكرولتر من ARC49 ، و 7.5 ميكرولتر من برايمر الفهرس الفريد ، و 25 ميكرولترا من المزيج الجاهز للبدء الساخن 2X. أضف 10 ميكرولترات من عينة الحمض النووي إلى كل تفاعل. قم بتضخيم المكتبة باستخدام الشروط التالية.

تشوه الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، تليها 18 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، وتنتهي باستطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين. امسك العينات عند أربع درجات مئوية بعد التضخيم. قم بتنقية المكتبات كما هو موضح في بروتوكول النص وقم بإزالتها بسعة 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت TE.

تحديد الجودة ومتوسط حجم الأجزاء لكل مكتبة باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الرقمي. تظهر النتائج التمثيلية لملفات تعريف المكتبة المناسبة بعد معالجة هيدروكسيد البوتاسيوم أو كلوريد البوتاسيوم. بعد حساب تركيز كل مكتبة ، اسحب كميات مولية متساوية تصل إلى 24 مكتبة مكبرة باستخدام بادئات فهرس مختلفة للتسلسل كما هو موضح في القسمين 9 و 10 في بروتوكول النص.

أضف المخزن المؤقت TE إلى الحجم النهائي البالغ 25 ميكرولتر وتركيز 10 نانو مولار. بعد التسلسل ، قم بإجراء تحليل بيانات المعلوماتية الحيوية على النحو المحدد في القسم 11 من بروتوكول النص. توضح هذه الرسوم البيانية القراءات الملخصة في جميع مواقع HincII في حبلا خفيف وخيط ثقيل من الحمض النووي للميتوكوندريا البشرية بعد معالجة كلوريد البوتاسيوم.

حوالي 70٪ من جميع النهايات الخمسة المكتشفة المترجمة إلى مواقع القطع ، مما يدل على الكفاءة العالية لهضم HincII. إن معالجة المكتبات بهيدروكسيد البوتاسيوم لتحلل الحمض النووي في الريبونوكليوتيدات المدمجة يقلل من عدد القراءات في HincII إلى حوالي 40٪ يكشف العدد النسبي للقراءات في الحمض النووي للميتوكوندريا والنووي عن الاختلافات في التغطية ويوضح أهمية التطبيع المناسب لإزالة تحيز الخيوط يعطي تطبيع عدد القراءة إلى HincII مقياسا كميا لعدد الريبونوكليوتيدات لكل جينوم الميتوكوندريا على الخيط الثقيل أو الخفيف.

تظهر القراءات بعد معالجة هيدروكسيد البوتاسيوم لكل ريبونوكليوتيد ، والتي تم تطبيعها وفقا لتكوين تسلسل كل خيط ، نسبة مختلفة عن واحدة ، مما يشير إلى توزيع غير عشوائي للقراءات ويشير إلى نمط ريبونوكليوتيد مميز وجودة مكتبة عالية. إن تطبيع القراءات في مواقع الريبونوكليوتيدات المدمجة لتلك الموجودة في مواقع HincII ، وكذلك لمحتوى نيوكليوتيدات الجينوم ، يولد مقياسا كميا لعدد كل ريبونوكليوتيد مدمج لكل 1000 قاعدة تكميلية. بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في غضون يومين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الحمض النووي في لباقة عالية وتجنب إدخال أي فواصل مزدوجة أثناء إعداد المكتبة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تأكيد بيانات القياس الكمي للريبونوكليوتيدات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد المكتبات لرسم خرائط وقياس كمية الريبونوكليوتيدات والحمض النووي باستخدام تسلسل الجيل التالي.

لا تنس أن العمل مع مواد كيميائية مثل هيدروكسيد البوتاسيوم يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء واقي العين والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.