التصور إكسون ثالاموكورتيكال المتفرعة والمشبك تشكيل في كوكولتوريس أورجانوتيبيك

الهدف العام من هذه الطريقة هو دراسة التغيرات المورفولوجية الديناميكية لتفرع المحور العصبي وتكوين المشبك في إسقاط المهاد القشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل تكوين الدوائر العصبية الجديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الملاحظة المتزامنة لنمو المحور العصبي وتكوين المشبك في الخلايا الحية الفردية.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للعلاقة بين تفرع المحور العصبي وتكوين المشبك في الإسقاطات القشرية المهادية. يمكن تطبيقه أيضا على الدوائر العصبية الأخرى ، مثل الاتصال الجوهري في القشرة الدماغية. لبدء هذا الإجراء ، قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق أو أكثر.

بعد ذلك ، قم بتشريح الدماغ بالكامل بسرعة من فأر ما بعد الولادة في اليوم الثاني تحت التخدير المثلج. بعد ذلك ، ضع الدماغ في طبق بتري بحجم 100 ملم يحتوي على 40 مل من محلول الملح المتوازن البارد من هانك. تحت المجهر المجهري ، قم بإزالة مادة pia بعناية باستخدام ملقط دقيق ، وقم بتقطيع القشرة البصرية والحسية الجسدية الأولية إلى شرائح بسمك 300 إلى 400 ميكرون باستخدام مقص الجراحة المجهرية.

بعد ذلك ، انقل الشرائح القشرية إلى مرشح الغشاء الخاص بملحق المزرعة باستخدام ماصة بلاستيكية يمكن التخلص منها. اضبط مواضع الشرائح بالقرب من مركز ملحق المزرعة باستخدام الماصة البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة ، وقم بإزالة الوسط الزائد من الملحق. الحفاظ على الشرائح في وسط المزرعة المحتوي على المصل عند 37 درجة مئوية ، وزرعها بمفردها لمدة يوم واحد قبل وضع كتلة مهادية من جنين E15 بجانبها.

اضبط مستوى الوسط أسفل سطح الشريحة قليلا ، بحيث يمكن للشرائح أن تتلقى إمدادات كافية من كل من الغاز والوسط. هذا أمر بالغ الأهمية لصلاحية الشرائح. في هذه الخطوة ، اصنع الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب قطب.

ثم كسر أطراف الشعيرات الدموية الزجاجية لحقن البلازميد. بالنسبة لماصات القطب الكهربائي ، قم بطحن وتلميع أطراف الشعيرات الدموية الزجاجية بورق الصنفرة. ثم قم بتلميعها بالنار لتحقيق قطر داخلي من 50 إلى 200 ميكرون.

بعد ذلك، قم بتوصيل ماصة القطب الكهربائي وماصة الطرد بالمتلاعبين. انقل خمسة ميكرولترات من محلول البلازميد إلى طبق بتري. ثم اسحب المحلول في ماصة القطب الكهربائي بعمل شعري.

أدخل القطب الكهربائي الذي قطره 0.2 ملم في ماصة القطب. بعد توصيل ماصة الطرد بحقنة سعة مليلتر واحد بأنبوب بلاستيكي ، انقل خمسة ميكرولترات من محلول البلازميد إلى طبق بتري مرة أخرى. ثم اسحب المحلول ببطء إلى ماصة الإخراج باستخدام المحقنة.

بعد ذلك ، انقل الزراعة المشتركة في مرحلة التثقيب الكهربائي وأدخل القطب الكهربائي الذي يبلغ قطره ملليمتر واحد في وسط الاستزراع. بعد ذلك ، ضع ماصة الطرد على كتلة المهاد المستزرعة. ادفع المحقنة يدويا بعد أن يلامس الطرف سطح الكتلة المهادية.

ضع ماصة القطب الكهربائي على كتلة المهاد مباشرة بعد سحب ماصة الإخراج. الآن ، قم بتوصيل النبضات الكهربائية. مراقبة السعة وعدد القطارات على راسم الذبذبات.

بعد ذلك ، اسحب ماصة القطب وأعد الطبق إلى الحاضنة. لمراقبة العينة ، ضع طبق الثقافة على مسرح مجهر متحد البؤر المستقيم المجهز بمجموعتي مرشح ل EGFP و DsRed. ثم التقط صورا من 10 إلى 25 قسما بصريا ، بأحجام خطوة واحدة إلى سبعة ميكرون ، باستخدام عدسة موضوعية لمسافة العمل الطويلة 20x.

حدد المحاور المسماة التي يمكن تمييزها بشكل فردي ، والتي تعبر عن كل من DsRed و Syp-EGFP. يظهر هنا زراعة عضوية مشتركة لشرائح المهاد والقشرية بعد 12 DIV. فيما يلي صورة مكبرة للمنطقة المعبأة.

وهنا خلية مهاد تحمل علامة DsRed تمتد محورا عصبيا إلى الشريحة القشرية ، وتشكل فروعا في الطبقات العليا. تظهر هذه الصور محور المهاد القشري المسمى DsRed و Syp-EGFP puncta. لوحظ تراكم منفصل ل Syp-EGFP على طول محور عصبي قشري مهاد واحد.

تم إدخال بلازميدات DsRed plus Syp-EGFP في خلايا المهاد المستنبتة في DIV واحد باستخدام التثقيب الكهربائي. تم تصوير هذا المحور العصبي يوميا على مدار أربعة أيام. كان تفرع المحور العصبي وتشكيل المشبك ديناميكيا ، مع الإضافة والإزالة.

باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء التثقيب الكهربائي مع الجينات المثيرة للاهتمام جنبا إلى جنب مع Syp-EGFP و DsRed من أجل التحقيق في دور الجين في تفرع المحور العصبي وتكوينات المشبك. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف آليات التغيرات الديناميكية للدوائر العصبية.