تطبيق نظام الثقافة Explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس في هيماتوبويسيس الإنمائية
نوفمبر 3, 2017
ويصف هذا البروتوكول استخدام مثقف الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس لتعبير تحاليل، الوحدات المكونة للمستعمرة في الثقافة والطحال، وإعادة بناء طويلة الأجل لتحديد تأثير العوامل التنظيمية ومسارات الإشارات على الجذعية المكونة للدم خلية التنمية. وقد ثبت كنظام فعال لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم ووظيفة.
الهدف العام من هذه التجربة هو استخدام ثقافة زرع الشريان الأورطي والغدد التناسلية المتوسطة للتحقيق في المنظمين الهامين لتطور الخلايا الجذعية المكونة للدم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا HSC ومجالات الوظائف حول كيفية تحديد العوامل المشاركة في تنظيم تطور HSC في الثدييات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التحقق من هذه المنظمين من خلال تحليل تعبير الحمض النووي وقدرة تكوين المستعمرة وقدرة إعادة تكوين HSC.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الفصل الدقيق ل AGM عن الأنسجة المحيطة في منطقة الجذع يتطلب ممارسة لإتقانها. قبل البدء في الإجراء ، ضع شبكات من الفولاذ المقاوم للصدأ في آبار فردية من صفيحة من ستة آبار تحتوي على ملليلترين من وسط محضر حديثا مكمل بفلوكستين لكل بئر. ضع مرشحا واحدا معقما بالأشعة فوق البنفسجية سعة 0.65 ميكرولتر لكل بئر تجريبي في طبق زراعة الخلايا الزجاجية الذي يحتوي على ماء مغلي عذب لمدة غسلتين لمدة ثلاث دقائق ، وغمر المرشحات في وعاء من PBS بدرجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين بعد كل غسلة.
ثم ضع مرشحا واحدا على كل شبكة فولاذية في واجهة الهواء السائل لكل بئر. بعد ذلك ، استخدم مقص التشريح لتجريد الرحم من فأر حامل في اليوم 11 من الجنين وحصاد الأجنة من الرحم. باستخدام مقص التشريح ، قم بإزالة كيس الصفار والحبل السري والأحشاء من جسم الجنين.
وإزالة الأنسجة العصبية الظهرية والأنسجة العضلية المحيطة بعناية. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الأنسجة من الأطراف الأمامية والخلفية. وفصل منطقة AGM عن جسم الجنين.
ثم ضع كل AGM على مرشح واحد في واجهة الهواء السائل لكل بئر. ضع المزارع في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بنقل عينات AGM إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مليلتر تحتوي على 200 ميكرولتر من الكولاجيناز لتفكيكها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا مع الرج كل خمس دقائق.
في نهاية الهضم ، أوقف التفاعلات مع 200 ميكرولتر من المصل لكل نبتة. انقل محتويات كل أنبوب بالكامل إلى آبار فردية من لوحة مرفقة منخفضة للغاية مكونة من 24 بئرا تحتوي على 500 إلى 600 ميكرولتر من متوسط M3434 لكل بئر. امزج الخلايا في كل بئر بحقنة ملليلتر واحد بدون إبرة.
ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. يمكن بعد ذلك تسجيل عدد وحدات تكوين المستعمرات داخل كل بئر بعد سبعة إلى 10 أيام من الاستزراع. بالنسبة لزرع الزرع في الجسم الحي AGM بعد يومين إلى ثلاثة أيام من ثقافة AGM كما هو موضح للتو ، قم بإشعاع ستة فئران سوداء من الذكور C57 البالغة من العمر ثمانية إلى 10 أسابيع مع تسعة رمادي من الإشعاع.
بعد أربع إلى خمس ساعات ، قم بفصل النباتات المسبقة المحصودة في 200 ميكرولتر من الكولاجيناز لكل عينات كما هو موضح. حمولة 0.5 إلى جنين واحد مكافئ من المعلقات أحادية الخلية الناتجة في حقنة واحدة سعة مليلتر واحد لكل متلقي. ضع أول فأر مشع في مصفاة وامسح الذيل بقطعة قطن مبللة بالإيثانول بنسبة 75٪ لتعزيز توسع الأوعية في وريد الذيل.
حقن محتوياتحقنة واحدة بالكامل عن طريق الوريد في وريد الذيل المتوسع. استخدم مسحة مطهرة لوقف النزيف بعد إزالة الإبرة. ثم أعد إلى قفصه ، وحقن التالي.
بعد 11 يوما من النقل بالتبني ، يمكن تثبيت الطحال في محلول بوين للتعداد العياني لمستعمرات الطحال المرئية. تظهر مزارع AGM المكملة بفلوكستين تعبيرا متزايدا عن Runx1 ، وهو جين محوري لتطور HSC على مستويات mRNA والتعبير عن البروتين. يمكن أن يزيد فلوكستين أيضا بشكل كبير من قدرة تكوين مستعمرة HSC في AGM بما في ذلك الأحمر الوحمي لوحدة تشكيل الانفجار ، والخلايا الوحيدة الحبيبية لوحدة تشكيل المستعمرات والخلايا الحبيبية لوحدة تكوين المستعمرة ، وكريات الدم الحمراء ، والضامة ، والخلايا الضخمة النواة.
علاوة على ذلك ، يؤدي زرع HSC المعالج بالفلوكستين المعزول من AGM إلى زيادة أعداد المستعمرات في طحال المتلقية البالغة المشععة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل AGM وإجراء ثقافة الزرع AGM لتحديد المنظمين الهامين لتطوير HSC داخل AGM.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول استخدام مستنبتات الشريان الأبهر-الغدد التناسلية-الكلى المتوسطة (AGM) لإجراء تحليلات التعبير ووحدات تكوين المستعمرات لدراسة تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC). ويعد هذا نظاماً فعالاً لاستقصاء العوامل التنظيمية ومسارات الإشارات المشاركة في بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم
- تقنيات زراعة الخلايا
- العوامل التنظيمية في التطور
خلفية علمية
- تعد منطقة AGM حاسمة لتطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) في الثدييات.
- يمكن أن يؤدي فهم تنظيم الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى تطورات في الطب التجديدي.
- تعتبر مقايسات تكوين المستعمرات ضرورية لتقييم وظائف الخلايا الجذعية المكونة للدم.
- يتطلب فصل منطقة AGM عن الأنسجة المحيطة المهارة والممارسة.
الغرض من الدراسة
- لبحث المنظمات الحرجة لتطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
- لتحديد العوامل المشاركة في تنظيم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
- لتعزيز فهم بيولوجيا ووظيفة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
الطرق المستخدمة
- تقنيات زراعة المستأصلات من AGM.
- تحليل التعبير عن DNA للتحقق من العوامل التنظيمية.
- مقايسات تشكل المستعمرات لتقييم قدرة HSC.
- دراسات إعادة التشكيل طويلة المدى.
النتائج الرئيسية
- تحديد العوامل التنظيمية الرئيسية التي تؤثر على تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
- التحقق من العوامل من خلال تحليل تعبير DNA.
- الإثبات الناجح للقدرة على تكوين مستعمرات في الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) المستزرعة.
- فهم مسارات الإشارات المشاركة في بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
الاستنتاجات
- يعد نظام استزراع AGM فعالاً لدراسة تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
- يمكن لفهم العوامل التنظيمية أن يوجه الاستراتيجيات العلاجية.
- توفر هذه الطريقة منصة للأبحاث المستقبلية في عملية تكوين الدم.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج نظام زراعة مستأصل الغشاء السلوي المعوي (AGM) عقبة رئيسية في أبحاث الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) من خلال تمكين الدراسات الميكانيكية دون الحاجة إلى نماذج تعطيل الجينات في الخط الجرثومي. يدعم هذا النهج التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر في مراحل الاكتشاف المبكرة عن طريق السماح بتجارب الإنقاذ الدوائية أو الجينية في بيئة جنينية ذات صلة فسيولوجياً. وهو ما يعزز الثقة التنبؤية في تحديد المنظمات الحرجة لتطور الخلايا الجذعية المكونة للدم، مما يوجه قرارات المحفظة الاستثمارية في المجالات العلاجية التي تركز على تكوين الدم.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال اختبار مشاركة عامل معين في تنظيم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) عبر تجارب الإنقاذ في خلفيات جينية معطلة (KO).
- القيمة التشغيلية: توفر نظاماً قابلاً للتكرار للتحقق من تغيرات التعبير عن الحمض النووي (DNA) والمخرجات الوظيفية مثل تكوين المستعمرات، مما يقلل الاعتماد على النماذج الحية المكلفة.
- القيمة التنبؤية: تدعم الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال ربط الاضطرابات الجزيئية بمخرجات الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) الوظيفية، مثل قدرة إعادة التشكيل.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يولد قراءات كمية متعددة الخلايا تشمل مستعمرات CFU-E وCFU-GM ومستعمرات الخلايا الكريوية لتقييم تأثيرات المركبات على تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC).
- القيمة التشغيلية: يوحد التقييم الوظيفي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) عبر حساب وحدات تشكيل المستعمرات بعد 7–10 أيام، مما يتيح إمكانية توسيع نطاق المقايسة عبر مكتبات المركبات.
- القيمة الانتقالية: يجهز مجموعات مثبتة من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) لدراسات الزرع اللاحقة، مما يربط مرحلة الاكتشاف بالتحقق من الصحة قبل السريري.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على الصلة بالمرض من خلال حماية المناشئ المكونة للدم الجنينية، مما يسمح بدراسة آليات تطور الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) في الثدييات.
- القيمة التشغيلية: يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى العمل قبل السريري من خلال توليد خلايا HSC قابلة للزرع مع إثبات قدرتها على إعادة التشكيل في المستقبلقين الذين تعرضوا للإشعاع.
- تخفيف المخاطر: يتيح التحقق الوظيفي من الأهداف قبل إجراء الدراسات المكلفة داخل الجسم الحي، مما يعزز الثقة في قرارات المتابعة أو التوقف.
تكامل مسارات العمل وسير العمل
تندرج زراعة مستأصلات الغشاء الجنيني للأوعية الدموية (AGM) ضمن سلسلة الاكتشافات التي تبدأ من تحديد الهدف، مروراً بتحسين المركبات الواعدة، وصولاً إلى التحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية، لا سيما في برامج تكوين الدم والطب التجديدي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات التأشير والمنظمات النسخية التي تؤثر على ظهور الخلايا الجذعية المكونة للدم وتوسعها.
- الفحص: يوفر مخرجات مستعمرات كمية تعتمد على الفلورة أو المجهر، مما يدعم تحليل الاستجابة للجرعة وتأكيد النتائج الإيجابية.
- التحليلات: تتيح التقييم متعدد المعايير عبر تعبير mRNA/البروتين (مثل Runx1)، وشكل المستعمرات، ووحدات إعادة التوطين في الجسم الحي.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج الميكانيكية بالاستمرارية قبل السريرية من خلال إثبات إعادة التكوين على المدى الطويل في نماذج الزرع التنافسي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة قابلة لإعادة الاستخدام للتحقق التكراري من الأهداف عبر مشاريع متعددة في المجالات العلاجية للخلايا الجذعية واضطرابات الدم.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الموثوقية في تحديد الأهداف من خلال ربط التدخلات الجزيئية بالأنماط الظاهرية الوظيفية للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) في نظام دقيق تطوريًا.
- القيمة التشغيلية: تعزز قابلية التكرار من خلال بروتوكولات موحدة لعزل المستنبتات وزراعتها وتفريقها، مما يقلل من التباين في المقاييس الوظيفية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين تقليل المخاطر في المراحل المبكرة لأهداف الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC)، مما يقلل من حالات الفشل في المراحل المتأخرة الناتجة عن نقص الرؤى الميكانيكية.
- تأثير المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير بيانات وظيفية حول قدرة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) على التجديد الذاتي والتمايز لتصنيف الأهداف.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التشريح الجنيني وتقنيات الجراحة المجهرية لعزل منطقة AGM دون تلوث من الأنسجة المحيطة.
- تعتمد على بنية تحتية معقمة لزراعة الخلايا، بما في ذلك حاضنات CO2، وأطباق ذات التصاق منخفض، والترشيح المعقم للوسط والكواشف.
- تستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص وضع المستنبت النسيجي، وتوقيت الهضم باستخدام الكولاجيناز، ومعايير تقييم المستعمرات لضمان إمكانية مقارنة البيانات.
- قد يكون التكيف مع النماذج غير الفأرية محدوداً بسبب التوقيت الجنيني الخاص بكل نوع وإمكانية الوصول إلى الأنسجة، مما يتطلب التحقق من الصحة في كل نظام.
- تشمل القيود العملية النافذة الجنينية الضيقة (E10.5–E11.5 في الفئران) لعزل AGM، مما يؤثر على الإنتاجية والجدولة في حملات الاكتشاف.
