تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول
مارس 12, 2018
ويصف هذا البروتوكول مقايسة غزو عمودي مقلوب التي يمكن أن تستخدم لقياس قدرات الهجرة وغزو الخلايا في أجواء ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على المكروية الخلية. هذا التحليل مناسبة لخلايا نادرة و/أو الحساسة.
الهدف العام من اختبار الغزو هذا هو تحديد القدرات المهاجرة والغازية للخلايا النادرة والحساسة في بيئة ثلاثية الأبعاد دون إزاحة الخلايا من بيئتها الدقيقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث السرطان حول قدرة غزو الأحداث الحساسة والأحداث السرطانية ، مثل منتج اندماج الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا يتم تحليلها في بيئتها الدقيقة الأصلية باستخدام إعداد ثلاثي الأبعاد.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج السرطان لأنه يمكن استخدامها لفحص العوامل الدوائية القادرة على تثبيط غزو الخلايا السرطانية والورم الخبيث. العرض المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية. يؤثر الشفط في درجة الحرارة ودرجة الحموضة لخليط الكولاجين على بلمرته ويؤدي التعامل الخشن مع الجل إلى انفصال الجل.
ابدأ بمعالجة طبق استزراع 35 ملم بقاع زجاجي 10 ملم بئر مع مليلتر واحد من حمض الهيدروكلوريك المولي لتقليل الكراهية للماء في الزجاج. بعد 15 دقيقة ، اغسل الطبق مرتين بمليلتر واحد من PBS لكل غسلة ، متبوعا بغسل واحد بمليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، اشطف اللوحة بملليلتر واحد من وسط الثقافة الخاص بالخلايا ذات الأهمية التي سيتم استخدامها.
وبذر اللوحة بالخلايا ذات الأهمية. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 100٪ ، اجمع بين 114.5 ميكرولتر من كولاجين ذيل الفئران المحضر حديثا ، و 16.6 ميكرولتر من 10 × وسط DMEM ، و 33.1 ميكرولتر من وسط الاستزراع المكمل بجاذب كيميائي ذي أهمية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد.
قم بتحييد خليط الكولاجين ب 14 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم وتراكب الخلايا ب 80 ميكرولتر من الجل. اسمح للكولاجين بالبلمرة في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم ضع ملليلترين من وسط زراعة خلايا المصل المخفضة بنسبة 2 في المائة فوق الجل وأعد الخلايا بعناية إلى الحاضنة للفترة الزمنية التجريبية المناسبة دون إزاحة الكولاجين.
في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الوسط برفق وشطف الجل بعناية باستخدام مليلتر واحد من PBS. قم بإصلاح الخلايا بمليلتر واحد من أربعة بالمائة بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة متبوعا بغسلتين في ملليلتر واحد من PBS لكل غسلة. ثم قم بتسمية الخلايا بمحلول DAPI لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بتصوير غزو الكولاجين ثلاثي الأبعاد في المختبر بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
هنا ، يتم عرض القياس الكمي لغزو هلام الكولاجين بواسطة خط خلايا سرطان الثدي ومنتجات اندماج خلايا سرطان الثدي استجابة لجاذب كيميائي على مدى فترة هجرة مدتها 48 ساعة. والجدير بالذكر أنه لوحظ أيضا هجرة منتجات اندماج خلايا سرطان الثدي النادرة إلى هلام الكولاجين استجابة للجاذب الكيميائي. تظل الخلايا بصحة جيدة طوال تجربة هلام الكولاجين ، كما يتضح من الحفاظ على أعداد الخلايا القوية وتشكلها بعد 48 ساعة من بلمرة الجل.
يسمحاختبار هلام الكولاجين العمودي هذا أيضا بحركية هجرة الخلايا عند الغزو ، ليتم تحليلها عن طريق تصوير هجرة الخلايا في سلسلة Z بالإضافة إلى مورفولوجيا الخلايا المهاجرة التي سيتم التقاطها في الموقع. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام طبق ثقافة متوافق مع المجهر. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إدخال متغيرات أخرى مثل تعديل قوة الكولاجين أو استخدام جاذبات كيميائية مختلفة للإجابة على أسئلة إضافية حول تأثيرات مشاركة ECM على غزو الخلايا أو جاذبات العلاج الكيميائي المختلفة على غزو الخلايا ، على التوالي.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء والسرطان للكشف عن مثبطات الدوائية للورم الخبيث وكذلك لاستكشاف التئام الجروح في جميع الاستجابات الالتهابية في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم القدرة المهاجرة والغازية للخلايا النادرة والحساسة ، في بيئة ثلاثية الأبعاد ، دون تشويه الخلايا على التدخل الجزئي. لا تنس أن المشي مع الخلايا السرطانية البشرية وحمض الهيدروكلوريك وبارافورمالدهيد و DAPI يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات ، مثل استخدام خزانة الصرف الصحي الحيوي رقم اثنين وعقد الدخان يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول مقايسة الغزو الرأسي المقلوب التي تحدد كمياً قدرات الهجرة والغزو للخلايا النادرة والحساسة في بيئة ثلاثية الأبعاد مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للخلايا. وتكتسب هذه الطريقة أهمية خاصة في أبحاث السرطان.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- هجرة الخلايا
- أبحاث السرطان
- مقايسات الغزو
خلفية علمية
- يتيح هذا الاختبار تحليل الخلايا في بيئتها الدقيقة الأصلية.
- لقد صُمم هذا الاختبار للخلايا النادرة والحساسة.
- يعد فهم غزو الخلايا أمرًا بالغ الأهمية لتطوير علاجات السرطان.
- يعد التوضيح المرئي لهذه التقنية ضروريًا للتنفيذ السليم.
الغرض من الدراسة
- تحديد كمية القدرات المهاجرة والاجتياحية للخلايا.
- استكشاف القدرة الاجتياحية للخلايا الحساسة.
- فحص العوامل الصيدلانية التي تثبط اجتياح الخلايا السرطانية وانتشارها.
الطرق المستخدمة
- مقايسة الغزو الرأسي المعكوس
- زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد
- تحليل الخلايا في بيئتها الدقيقة
- تقييم تأثيرات درجة الحرارة والأس الهيدروجيني (pH) على بلمرة الكولاجين
النتائج الرئيسية
- إثبات القدرة على تحليل سلوك الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد.
- تسليط الضوء على أهمية الحفاظ على البيئة الدقيقة للخلايا.
- تقديم رؤى حول القدرات الغازية للخلايا السرطانية.
- إظهار إمكانية فحص العوامل العلاجية.
الاستنتاجات
- يُعد هذا الاختبار أداة قيمة لأبحاث السرطان.
- فهو يحافظ على البيئة الدقيقة للخلايا الحساسة.
- ويمكن أن يساعد في تطوير علاجات تستهدف غزو السرطان وانتشاره.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح هذا المقايسة لفرق البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية تقييم القدرة الغزوية لنماذج خلوية نادرة وحساسة ضمن بيئة مجهرية ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية، دون تعطيل التفاعلات الأصلية بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلوية (ECM). ومن خلال الحفاظ على المكان الخلوي الأصلي، تدعم هذه الطريقة تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف المرتبطة بالنقائل السرطانية، وتعزز الثقة التنبؤية في مرحلة التحقق المبكر من الأهداف. كما تعالج هذه الطريقة فجوة حرجة في الفحص قبل السريري حيث تؤدي المقاييس التقليدية إلى الإخلال بسلامة البيئة المجهرية، مما يعزز الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تقييم الغزو في نماذج خلوية نادرة أو مشتقة من اندماج تحت ظروف بيئية مجهرية طبيعية.
- القيمة التشغيلية: تقلل من التباين الاصطناعي الناتج عن إزاحة الخلايا، مما يحسن من إمكانية تكرار أنماط الغزو الظاهرية عبر التجارب.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر المرتبطة بالأهداف العلاجية من خلال ربط الاضطرابات الجزيئية بنتائج الغزو الوظيفية في سياق ثلاثي الأبعاد.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولد مقاييس غزو كمية ومعيارية متوافقة مع التصوير عالي المحتوى وسير عمل التحليل الآلي.
- قابلية التكرار: تقلل من التباين بين الآبار من خلال القضاء على الاضطراب الميكانيكي لطبقات الخلايا أثناء إعداد المقايسة.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع تركيزات الكولاجين والمواد الجاذبة الكيميائية المتنوعة، مما يتيح دراسات العلاقة بين البنية والنشاط (SAR) لمثبطات النقائل.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج عملية غزو السرطان البشري باستخدام خلايا هجينة من الخلايا الليفية والظهارية تعكس التفاعلات بين السداة والورم داخل الجسم الحي.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين النتائج المختبرية والتحقق من الصحة في المرحلة قبل السريرية عن طريق الحفاظ على إشارات البيئة الدقيقة الضرورية لسلوك الغزو.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: يوفر بيانات وظيفية عن الغزو لتحديد أولويات الأهداف أو المركبات مع تقليل احتمالية الفشل في المراحل المتأخرة بسبب ضعف نمذجة البيئة الدقيقة.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يتناسب هذا المقايس مع تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث يوفر بديلاً يحافظ على البيئة الدقيقة لأنظمة غرف بويدن (Boyden Chamber) أو أنظمة ترانسويل (transwell) المستخدمة في البرامج المتعلقة بالنقائل السرطانية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم الاختبار القائم على الفرضيات لمسارات الغزو من خلال تمكين التصوير الفوري بنظام z-stack لهجرة الخلايا داخل هلامات الكولاجين الفسيولوجية.
- الفحص: يوفر بيانات نقطة النهاية للغزو المناسبة لفحص مكتبات المركبات، لا سيما العوامل التي تستهدف إعادة تشكيل الـ ECM أو إشارات الانجذاب الكيميائي.
- التحليلات: يتيح تحديد كمية عدد الخلايا الغازية والتحليل المورفومتري، مما يوفر قراءات متعددة المعايير للارتباط بين البنية والوظيفة.
- الأبحاث الانتقالية: ينمذج الغزو الذي يتوسطه السدى باستخدام هجائن MSC والسرطان، مما يدعم الدراسات الميكانيكية المرتبطة بالمؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابل للتكيف عبر أنواع السرطان والمزارع المشتركة للسدى، مما يعزز إعادة استخدام المنصة في برامج النقيلة والتئام الجروح.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من الهدف من خلال تقليل النتائج الإيجابية الكاذبة الناتجة عن اضطراب البيئة الدقيقة.
- القيمة التشغيلية: تعزز متانة المقايسة من خلال بروتوكولات موحدة لبلمرة الهلام والتغطية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن جودة قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير بيانات غزو ذات صلة فسيولوجياً في مرحلة مبكرة من مسار العمل.
- التأثير على المحفظة: تتيح التقدم في تطوير مثبطات النقائل بناءً على تصنيف المخاطر ووفقاً لملفات الغزو الوظيفي ثلاثية الأبعاد (3D).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد والمجاهر البؤرية (confocal microscopy) لضمان القياس الكمي الدقيق للغزو الخلوي.
- يعتمد على التحكم الدقيق في درجة الحرارة والـ pH أثناء تحضير الكولاجين لضمان بلمرة متسقة للهلام.
- يستلزم توحيد جرعات المواد الجاذبة كيميائياً وظروف الأوساط الغذائية المختزلة المصل لضمان استجابات انتحاء كيميائي قابلة للتكرار.
- قد يتطلب التكيف مع بروتينات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) البديلة (مثل Matrigel أو الفبرين) تحسيناً لحركية الهلام وتركيزه.
- يقتصر على الخلايا الملتصقة أو شبه الملتصقة القادرة على الغزو للأعلى عبر طبقة الهلام؛ وقد تتطلب المعلقات غير الملتصقة تعديلاً في البروتوكول.
