الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

الهدف العام لهذه المنهجية هو اكتساب وتحليل ديناميكيات عدد كبير من الخلايا الملتصقة التي تتم مراقبتها عن طريق الفحص المجهري بالفيديو الخالي من العدسات. لذلك ، نعتقد أن هذه التقنية مثيرة للاهتمام في العديد من مجالات علم الأحياء ولدراسة تكاثر الخلايا أو التهاب المثانة الخلوي أو فحص الأدوية ، أو مراقبة العمليات الحيوية المختلفة. لذا فإن هذه التقنية خالية من الملصقات وهي بسيطة للغاية.

لكنها فعالة جدا في دراسة مجموعات الخلايا الكبيرة. ما هي فكرة هذه الطريقة ، عندما انتقلنا من مجال الكشف عن البكتيريا إلى مجال تصوير خلايا الثدييات. ثم كان من المفيد أن عالم الأحياء ، سيحتاجون إلى اكتساب الفاصل الزمني للدائرة مباشرة في الحاضنة.

ثم قمنا ببناء مجهر فيديو مخصص خال من العدسات متوافق مع الحاضنة وقمنا بتطوير خوارزمية إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للحصول على صورة لآلاف الخلايا الموجودة في مجال الرؤية الكبير جدا. ابدأ هذا الإجراء بطلاء صفيحة سفلية زجاجية مكونة من 6 آبار بالفبرونيكتين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة الفيبرونيكتين الزائد وشطف الصفيحة السفلية الزجاجية المكونة من 6 آبار باستخدام PBS.

تستخدم خلايا هيلا ، المزروعة في DMEM ، بالإضافة إلى وسط الجلوتامين ، المكملة بحرارة 10٪ في مصل عجل الجنين المنشط ، و 1٪ بنسلين وستربتومايسين في هذا العرض التوضيحي. بذر عشرين ألف خلية لكل لوحة ثقافة. من المهم استخدام وعاء ذو قاع زجاجي.

لجودة الاستحواذ الخالي من العدسة. ضع لوحة الثقافة في الحاضنة أعلى مجهر الفيديو الخالي من العدسة. مجهر الفيديو الخالي من العدسة المستخدم في هذا الاستحواذ بفاصل زمني متاح تجاريا.

يحتوي على مستشعر صورة أشباه موصلات بأكسيد معدني بمساحة تصوير تبلغ 29.4 ملم مربع ، ودرجة بكسل تبلغ 1.67 ميكرومتر. يتم توفير إضاءة متعددة طول الموجة بواسطة جهاز الصمام الثنائي الباعث للضوء متعدد الشرائح الموجود فوق ثقب 150 ميكرو متر على مسافة حوالي 5 سم من الخلايا. قبل البدء في الحصول على الفاصل الزمني ، من المهم التحقق من عدم وجود تكاثف على لوحة الغطاء.

لأن التكثيف سيؤدي إلى تدهور جودة صورة الاستحواذ. إذا حدث تكاثف على غطاء لوحة الثقافة ، فقم بتنظيف الغطاء. تحكم في المجهر الخالي من عدسات الفيديو باستخدام برنامج اقتناء متاح تجاريا.

الذي يقوم بكل من اكتساب الفاصل الزمني وإعادة البناء الثلاثي الأبعاد. أدخل معلمات الإدخال المطلوبة في واجهة البرنامج. اضبط معدل الإطارات، على 1 اكتساب كل 10 دقائق، ونوع مزرعة الخلية إلى التماسك، ومدة التجربة إلى 3 أيام.

ابدأ الاستحواذ على الفاصل الزمني. توضح هذه الصورة مثالا على مجال الرؤية الكامل لعملية اقتناء أولية في القناة الزرقاء على مساحة 29,4 ملم مربع في إطار واحد. اللوحة B هي تفاصيل اللوحة A ، واللوحة C هي تفاصيل اللوحة B. ستقوم خوارزمية إعادة البناء الثلاثية الأبعاد تلقائيا بمعالجة الاستحواذ الخالي من العدسة للحصول على صورة الطور لثقافة الخلية.

يتم عرض مثال على صورة للخلايا قبل فك الطور ، متبوعة بصورة بعد فك المرحلة. يتم تتبع الخلايا باستخدام خوارزمية TrackMate ، وهو مكون إضافي مفتوح المصدر في فيجي للتتبع الآلي للجسيمات المفردة. بعد التحميل ، يتم اكتساب اللقطات المتتابعة بالكامل في فيجي وتكوين الخوارزميات كما هو موضح في بروتوكول النص ، وتعيين معلمات الإدخال.

قم بتعيين قطر الكائن الثنائي كبير الحجم المقدر إلى 15 بكسل، وعتبة الكاشف على 0.25، والحد الأقصى لمسافة الربط إلى 15 بكسل، والحد الأقصى لمسافة إغلاق الفجوة إلى 15 بكسل، وعدد النقاط في المسار إلى 3.5. تتمثل الخطوة الأولى في خوارزمية تتبع الخلايا في اكتشاف الخلايا في الاستحواذ الخالي من العدسة. يتم عرض نتائج خوارزمية تتبع الخلايا ، مع عرض جميع مسارات الخلايا على أكثر من خمسين إطارا ، أو حوالي 8 ساعات.

مع رمز لون يتوافق مع السرعة المتوسطة. اللوحة السفلية عبارة عن صورة مفصلة للمستطيل الأصفر من اللوحة العلوية. يتم عرض مقطع فيديو تمثيلي لتتبع الخلايا هنا.

في نهاية عملية تتبع الخلية ، حدد زر التحليل لإنشاء النتائج في شكل 3 ملفات نصية. على أساس هذه البيانات ، قم بإجراء تجزئة الخلايا واكتشاف انقسامات الخلايا باستخدام خوارزميات مخصصة ، كما هو مفصل في بروتوكول النص وملفات التعليمات البرمجية التكميلية. ينتج عن تجميع جميع قياسات الخلية المفردة خلال اكتساب الفاصل الزمني الكامل مخططات مبعثرة لعدة مقاييس كدالة للوقت.

يزيد العدد الإجمالي للخلايا في مجال الرؤية الكامل من ألفين إلى خمسة عشر ألفا في 2.7 يوم. مضروبا في عدد النقاط الزمنية ، يؤدي هذا إلى مجموعة بيانات كبيرة من الخلايا المكتشفة. يتميز كل منها بإحداثياته وخصائصه المورفولوجية ، مثل الكتلة الجافة ، والمساحة ، ومتوسط السماكة ، وطول الوصول الرئيسي ، ونسبة العرض إلى الارتفاع.

الجمع بين خوارزميات تتبع الخلايا وتجزئة الخلايا إجراء قياسات حركية على مستوى الخلية الواحدة. يوضح هذا المثال تحليل مسار الخلية الذي يستمر حوالي ست وستين ساعة ، ويظهر 4 انقسامات خلوية في النقاط الزمنية المحاطة بدائرة باللون الأصفر. تم حساب العديد من المقاييس كدالة للوقت: مساحة سطح الخلية ، والكتلة الجافة ، ومتوسط السماكة ، وحركة الخلية.

توزيع مدة دورة الخلية لمدة 2.7 يوم قريبا من agouzian. بمتوسط 16.5 ساعة. ترتبط أطوال دورة الخلية ، التي يتم قياسها تلقائيا ، ارتباطا جيدا بتلك التي يتم قياسها يدويا.

كما تم فحص معلمات أخرى ، مثل الكتلة الجافة الأولية للخلية ، والكتلة الجافة النهائية ، ومتوسط معدل النمو خلال دورة الخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التحليل الكامل للبيانات للحصول على الفاصل الزمني في غضون ساعات قليلة ، اعتمادا على تكوين وحدة المعالجة المركزية وأداء الأجهزة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا تحديد التركيز الأولي للخلية بعناية.

إذا كان تركيز الخلية الأولي كبيرا جدا ، فستفشل خوارزمية تتبع الخلية في تحديد مسارات الخلية بشكل صحيح. ولكن ، إذا كان تركيز الخلية منخفضا جدا ، فستكون إحصائيات التحليل الكامل منخفضة جدا أيضا. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليلات آلية مثل تتبع الخلايا للإجابة على أسئلة أخرى في مجالات: علم الأحياء أو علم الأحياء الأساسي أو الانجذاب الكيميائي.

هذه التقنية الجديدة ، تمهد الطريق أيضا لمراقبة سلالة الخلية التي نأمل أن تجلب نظرة ثاقبة مثيرة للاهتمام لدراسة دورة الخلية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الحصول على الفاصل الزمني عن طريق الفحص المجهري للفيديو الخالي من العدسات وكيفية تحليل عدد كبير من الخلايا.