ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

الهدف العام لهذه المنصة قبل السريرية هو توفير إجراء قياسي لتحديد وتوصيف الآليات التي تقود المقاومة المكتسبة للعلاجات المستهدفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تنفيذ محرك الجينوم في علم الأورام ، على وجه الخصوص ، معالجة الأسئلة الرئيسية حول عدم تجانس الورم والآليات المتعددة المسؤولة عن المقاومة المكتسبة للعلاج الموجه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي النهج الفعال من حيث الوقت والتكلفة الذي يسمح بالتحقيق في المختبر لآليات مقاومة العلاج الموجه.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج السرطان ، حيث لا تزال مقاومة الرئة تمثل تحديا للعلاجات المستهدفة الناشئة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للآلية التي تنطوي عليها مقاومة العلاج الموجه ، ولكن يمكن استخدامها أيضا لدراسة فعالية عوامل العلاج الكيميائي التقليدية. بشكل عام ، سوف يتأرجح المشغلون الذين يستخدمون هذه الطريقة مع جيل من المستنسخة الفرعية المقاومة للأدوية ، وهي الخطوة الأكثر صعوبة في توحيدها.

لقد تصورنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما وصفنا آلية المقاومة المكتسبة ل trastuzumab في خطوط خلايا سرطان المعدة الإيجابية HER. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث أن هناك حاجة إلى العديد من التقنيات لتوليد والتحقق من صحة النماذج المقاومة للأدوية في المختبر بما في ذلك استعادة الحساسية عن طريق ضربة قاضية للجينات. لبدء هذا الإجراء ، قم بزرع خلايا NCI N87 في قوارير استزراع 25 سم مربع.

أضف 10 ميكروغرام لكل مليلتر من trastuzumab إلى وسط المزرعة في كل قارورة. قم بتعريض الخلايا لهذه الجرعة الأولية حتى تستأنف النمو. بعد استئناف نمو الخلايا في غضون أسبوعين تقريبا ، قم بتعريض الخلايا لجرعة تركيز مائة ميكروغرام لكل مليلتر من trastuzumab.

استمر في زيادة تركيز التراستوزوماب تدريجيا في انتظار حتى تستأنف الخلايا النمو قبل كل تعرض ، حتى يتم الوصول إلى تركيز 400 ميكروغرام لكل ملليلتر. قد يظهر خط الخلية حساسية مختلفة للأدوية المختلفة. يتمثل أحد الحلول لهذه المشكلة في تعريض الخلايا لجرعات الدواء المتزايدة تدريجيا ، بدءا من جرعة تبلغ حوالي عشرة أضعاف الساعة من ذروة تركيز البلازما حتى تستمر الخلايا في النمو.

بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في 24 لوحة استزراع متعددة الآبار. تعريض الخلايا المصنفة لزيادة تركيزات مثبطات العلاج المستهدف من 100 ميكروغرام لكل مليلتر إلى 400 ميكروغرام لكل مليلتر. احتضن في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط وشطف الخلايا ب 10 ملليلتر من PBS-1X. قم بإزالة PBS-1X وأضف ما بين ملليلترات وثلاثة ملليلتر من محلول التثبيت. بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة محلول التثبيت وأضف ملليلترين من محلول بنفسجي بلوري 0.5٪ إلى كل بئر.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. بعد ذلك ، استخدم ماصة لشفط محلول البنفسجي البلوري بعناية. اغمر الأطباق في ماء الصنبور لشطف أي بقايا متبقية.

يجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى يومين. بعد ذلك ، استخدم مجهرا مقلوبا بتكبير 4X لحساب المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلية. احسب نسبة المقاومة النسبية IC50 كما هو موضح في بروتوكول النص.

للبدء ، قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق التربسين كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام مقياس كثافة الدم وتلوين Trypan Blue ، عد الخلايا. بعد ذلك ، قم بزرع 2.5 مرة من 10 إلى خمس خلايا على قارورة T-25 لكل حالة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف 12.5 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد siRNA الذي يستهدف الجينات أو التحكم السلبي siRNA oligonucleotide في الحد الأدنى من وسط التعداء الأساسي. أضف كاشف تعداء الجسيمات الشحمية الكاتيونية بنسبة 1: 1 مع قليل النوكليوتيدات. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، أضف 700 ميكرولتر من مزيج التعداء إلى كل قارورة T-25. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة يوم إلى ثلاثة أيام. استخدم RT-PCR وتحليل Western Blot للتحقق من الضربة القاضية الجينية.

بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في 24 لوحة استزراع متعددة الآبار. تعريض الخلايا لتركيزات متزايدة من مثبطات العلاج المستهدف من 100 ميكروغرام لكل مليلتر إلى 400 ميكروغرام لكل مليلتر. من أجل فعالية ضربة قاضية للجينات ، يجب أن تكون قليل النوكليوتيدات siRNA محددة لتقليل التعبير المستهدف.

الأدوات المصممة وقياس siRNA كان نفس الجين المستهدف مفيدة لهذا الغرض. احتضن في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما. قم بإزالة الوسيط وشطف الخلايا ب 10 مل من PBS-1X.

بعد إزالة PBS ، أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من محلول التثبيت. ثم قم بإزالة محلول التثبيت وإضافة محلول بنفسجي بلوري 0.5٪. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

باستخدام ماصة ، قم بشفط محلول البنفسج البلوري بعناية. بعد ذلك ، اغمر الأطباق في ماء الصنبور. يجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى يومين.

بعد ذلك ، استخدم مجهرا مقلوبا بتكبير 4X لحساب المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلية. في هذه الدراسة ، تزرع ثلاثة خطوط لخلايا سرطان المعدة تعبر عن مستوى عال من HER2 وحساسة للتراستوزوماب في وسط مزرعة يحتوي على العوامل العلاجية المستهدفة. من هذا ، يتم الحصول على ثلاثة استنساخ فرعي تتميز بنمط ظاهري مقاوم مستقر.

من بين المستنسخة الفرعية ، ينظر إلى HR NCI N87 على أنه الأكثر مقاومة للوصول إلى المقاومة النسبية IC50 عند 28.57. يدعم تحليل البروتين والتعبير الجيني الفرضية القائلة بأن الجين IQGAP1 يلعب دورا محوريا في النمط الظاهري للمقاومة للخط الفرعي HR NCI N87. كما هو موضح هنا ، فإن مستوى بروتين IQGAP1 هو خمسة أضعاف في الاستنساخ الفرعي المقاوم مقارنة بالخلايا الأبوية.

والتعبير الجيني IQGAP1 هو طبقة 2.5 ضعفا في الخط الفرعي HR NCI N87 مقارنة بالاستنساخ الفرعي الأصلي. ثم يتم إجراء إسكات الجينات IQGAP1 لتقييم دوره في تطوير النمط الظاهري لمقاومة trastuzumab. يؤكد الاختبار الاستمني فرضية أهمية IQGAP.

كما هو موضح هنا ، فإن إسكات الجينات يعيد حساسية الخلية تجاه trastuzumab ، مما يقلل من قيمة IC50 إلى سبعة ميكروغرام لكل مليلتر. ما أفكر فيه في هذا الإجراء مهم أن نضع في اعتباره أنه ليس من السهل عموما الحصول على استنساخ الخلايا الفرعية المقاومة للأدوية. وأن هذه الطريقة تنطوي على خطر فشل محتمل.

من خلال هذا الإجراء ، من الممكن الحصول على عدة خلايا من المستنسخة التي تتميز بآليات مختلفة تقود المقاومة المكتسبة للعلاجات المستهدفة. يجب أن يسمح تطوير الإجراء القياسي للنمذجة المختبرية لمقاومة العلاج المستهدف لباحث الأورام بالتحقيق في هدف جديد يدعم الأدوية للتغلب على مقاومة الأدوية التي تعد أكبر انتقاد لأحدث جيل من العلاجات.