تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية

وتساهم مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في نسبة كبيرة من مشاكل الصحة العمومية على الصعيد العالمي، مما يؤثر تأثيرا كبيرا على معدل وفيات البشر واعتلالهم. تتطلب الطرق التقليدية للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء معالجة معقدة للعينات وتستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، أثبتت المستشعرات الحيوية أنها طريقة كشف واعدة وشاملة مع مزايا الكشف السريع والتطبيق العملي.

يعتمد تطوير المستشعرات الحيوية على قطب كهربائي معدل مع جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك. تم تعديل قطب الكربون المطبوع على الشاشة لزيادة مساحة السطح النشط لقطب العمل. الميثيلين الأزرق المستخدم كمركب الأكسدة والاختزال له رابطة قوية مع الحمض النووي أحادي الجدول من الحمض النووي المسبار الثابت

هذه العلاقة ذات القرب العالي التي يمثلها تيار ذروة عالية. يحل تهجين الحمض النووي أحادي السبل بتسلسله التكميلي محل جزيئات الميثيلين الزرقاء المستعبدة ، مما يقلل من تيار قياس النبض التفاضلي. قد يكون هذا بسبب كمية أقل من الميثيلين الأزرق التي تم جمعها على سطح القطب المعدل مع الحمض النووي التكميلي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، والذي كان ناتجا عن تفاعل يتعذر الوصول إليه بين قواعد الجوانين.

يتغير لون المحاليل المحضرة بدءا من الأصفر إلى الأسود وأخيرا إلى الأحمر الياقوتي الداكن. يشير هذا إلى أن ملح الذهب قد تم تقليله بواسطة أيونات السترات. تم خلط حمض البولي لاكتيك المذاب مع محلول الجسيمات النانوية الذهبية المعدة مسبقا ثم تم تقليبه بشكل متجانس في درجة حرارة الغرفة ، والذي يدل بعد ذلك على أنه حمض متعدد اللاكتيك الذي استقر جزيئات الذهب النانوية.

استخدام التحليل الطيفي المرئي بالأشعة فوق البنفسجية ، وحيود الأشعة السينية ، والمجهر الإلكتروني للإرسال ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح للانبعاث الميداني مع مطياف الأشعة السينية المشتتة للطاقة لتوصيف جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك. تم نقل حوالي 25 ميكرولترا من المحلول المتجانس لجزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك بسرعة على الشاشة ، ومطبوع قطب الكربون وتجفيفه بالهواء لمدة 24 ساعة قبل الاستخدام. ثم تم تمييز الأقطاب الكهربائية المعدلة كهروكيميائيا في فيروسيانيد البوتاسيوم لقياس مساحة السطح النشطة ، والتحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية ، والتكرار ، والاستقرار.

تم تحديد تحسين حالة الشلل باستخدام ثلاثة عوامل ، تركيز الحمض النووي أحادي الشريطة يتراوح من 0.2 إلى 1.4 ميكرومولار ، والوقت الذي يتراوح من 30 إلى 220 دقيقة ، ودرجة الحرارة تتراوح من 25 إلى 75 درجة مئوية. من ناحية أخرى ، تم تحديد تحسين حالة التهجين من خلال عاملين ، وهما الوقت الذي يتراوح من خمس إلى 35 دقيقة ودرجة حرارة تتراوح من 25 إلى 75 درجة مئوية. تم غمر الأقطاب الكهربائية المعدلة المعالجة لاحقا في 20 ميكرومولار ميثيلين أزرق لمدة 30 دقيقة.

تمت إزالة الحمض النووي غير الممتص على وجه التحديد والأزرق الميثيلين الزائد عن طريق الغسيل بمحلول ملحي الأسيتات الخاموضة 4.5 ثم شطفه بالماء منزوع الأيونات. تم قياس ذروة التيار لتقليل الميثيلين الأزرق باستخدام تقنية قياس الفولتامتر النبضي التفاضلي. تم إجراء قياس قياس الفولتامتر النبضي التفاضلي باستخدام الرقم الهيدروجيني الملحي للفوسفات 7.0 الذي لا يحتوي على مؤشر.

تم إجراء إجراء مماثل لجميع التفاعلات. تم استخدام Vibrio parahaemolyticus كساللات مرجعية وثماني سلالات بكتيرية أخرى ، وهي العطيفة الصائمية ، والليستيريا monocytogenes ، والسالمونيلا التيفيموريوم ، والتهاب الأمعاء السالمونيلا ، و Klebsiella pneumoniae ، والإشريكية القولونية O157: H7 ، و Bacillus cereus ، و Vibrio alginolyticus من العامل الممرض الشائع المنقول بالغذاء للتحقق من صحة المستشعر الحيوي للحمض النووي الكهروكيميائي في هذه الدراسة. تم إجراء استزراع فرعي روتيني للسلالات البكتيرية على أجار كل أسبوعين للحفاظ على صلاحيتها.

تم تحديد كمية خلايا Vibrio parahaemolyticus باستخدام تقنية لوحة الانتشار. تم نقل ملليمتر واحد من مزرعة خلايا البكتيريا إلى تسعة ملليمترات من مرق الصويا التربتيكاز الذي يحتوي على 3٪ كلوريد الصوديوم للحصول على عامل تخفيف قدره 10. بعد ذلك ، تم نشر 0.1 مليلتر من كل عامل تخفيف يبدأ من عامل تخفيف لمرة واحدة من 10 إلى 10 أضعاف عامل التخفيف 10 على صفيحة من CHROMagar Vibrio لعد المستعمرات ، على التوالي.

تم الحصول على الكوكل من السوق الرطب ثم تم إحضاره بسرعة إلى المختبر في صندوق تبريد الثلج لتحليله. تم تقسيم الكوكل إلى مجموعتين ، وهما المجموعة المعالجة وغير المعالجة بافتراض أن الكوكل تم حصادها بشكل موحد من بداية الحصاد حتى وضعها في غرفة التبريد في السوق. تمت معالجة الكوكل في المجموعة المعالجة مسبقا عن طريق تخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة ، متبوعا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية عند 20 درجة مئوية لمدة أربع ساعات قبل استخراج الحمض النووي.

كان من المتوقع أن تؤدي درجة حرارة التجمد والتعرض للأشعة فوق البنفسجية المستخدمة للمجموعة الضابطة إلى قتلها أو على الأقل الحد من مسببات الأمراض المتراكمة بشكل طبيعي المنقولة بالغذاء في الكوكلي. لم يتم تطبيق نظام بسترة أعلى يبلغ 70 درجة مئوية ، حيث كان الهدف من الحالة الخاضعة للرقابة في هذه الدراسة هو تقليد الوضع الفعلي للقرنب الطازج. وفي الوقت نفسه ، تم تحليل عينات من المجموعة غير المعالجة مباشرة دون أي معالجة مسبقة بمجرد وصولها إلى المختبر.

تم غسل الكوكل بالماء المقطر وفركه خاليا من الأوساخ قبل إزالة الأنسجة من الأصداف باستخدام ملقط معقم وخزانة تدفق رقائقية. تم تجانس حوالي 10 جرامات من عينات أنسجة الكوكل مع الخالط في 19 مل من مرق الصويا المعقم التربتيكاز الذي يحتوي على 3٪ كلوريد الصوديوم لمدة 60 ثانية. ثم تمت إضافة كمية معروفة من مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء إلى تسعة ملليمترات من مرق العينة المتجانسة للعينات المسننة.

تم استخدام العينات غير المسننة كعنصر تحكم سلبي. تم سحب حوالي ملليلتر واحد من العينات في أنبوب إيبندورف لاستخراج عينة الحمض النووي والتي سيتم استخدامها في اختبار المستشعر الحيوي وتفاعل البوليميراز المتسلسل. ثم تم استخراج الحمض النووي الجيني لمسببات الأمراض المنقولة بالغذاء من العينات المسننة وغير المسننة.

تم استخراج الحمض النووي الجيني بعد إجراء تحلل مغلي معدل. تم طرد الحمض النووي الجيني عند 12،000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على تعليق واضح وحفظ المادة الطافية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها مرة أخرى. تم استخدام مقياس ضوئي حيوي لتحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الجيني المستخرج.

ثم تم تحديد هوية جميع السلالات باستخدام المقايسات الكيميائية الحيوية القياسية والتحقق منها عن طريق تسلسل جيني 16 SR RNA. أخيرا ، تم تغيير طبيعة الحمض النووي الجيني عند 92 درجة مئوية لمدة دقيقتين وتم تبريده بسرعة في الماء المثلج قبل تطبيق المستشعر الحيوي. تم إجراء مزيد من التأكيد لمسببات الأمراض المنقولة بالغذاء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يستهدف الجين المعني.

تم تحديد المنتج المضخم وأحجامه عن طريق الرحلان الكهربائي على 1.5٪ من هلام الاغاروز. تم التقاط صور الهلام باستخدام نظام توثيق الهلام. تم تأكيد توليد جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك من الأطياف المرئية فوق البنفسجية ، والتي تأسس نمو البلازما السطحية وذروة الرنين حوالي 540 نانومتر.

تمت الإشارة إلى تكوين ووجود جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك في نطاقات طول موجة تتراوح من 500 إلى 600 نانومتر ، اعتمادا على حجم الجسيمات. لوحظت جميع القمم البلورية لجزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك في المسرحين عند 31.7 و 38.2 و 44.4 و 64.7 و 77.7 درجة. زادت شدة الذروة البلورية أيضا مع دخول قمم الحيود الأوسع عند 31.7 درجة ، مما يعني أن الجسيمات النانوية الباردة كانت جزءا لا يتجزأ من حمض polylactic ويشير إلى تكوين هياكل نانوية ذهبية متعددة الأطوار.

من منحنى توزيع الجسيمات المجهرية الإلكترونية للإرسال وصور الجسيمات النانوية الذهبية المستقرة بحمض البولي لاكتيك ، يمكن ملاحظة أن جزيئات الذهب النانوية كروية الشكل تقريبا. كان حجم الجسيمات النانوية في حدود 37 نانومتر ، وهو أكبر قليلا من ذلك الذي تم الحصول عليه من صيغة شيرر ، مما يشير إلى طبيعة متعددة البلورات للجسيمات النانوية المركبة. تم حساب الحجم الرئيسي لجزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض البولي لاكتيك باستخدام معادلة شيرر من خلال تحديد عرض انعكاس 100 براج.

من الجدول ، تم حساب الحجم البلوري لجزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض البولي لاكتيك على أنه 27 نانومتر. من الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة للانبعاث الميداني ومع أطياف الأشعة السينية المشتتة للطاقة ، كان لقطب الكربون المطبوع على الشاشة المعدلة أعلى نسبة وزن من الذهب ، وأكبر كثافة ، وأكبر هيكل لتغطية الجسيمات النانوية. أكد طيف الأشعة السينية المشتتة للطاقة أن جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض البولي لاكتيك المنتجة كانت تتكون من الذهب فقط ولم تظهر أي عنصر آخر باستثناء الذروة المقابلة للكربون والأكسجين.

كانت إمكانات الذروة الأنودية والكاثودية متسقة بمعدلات مسح مختلفة مما يشير إلى أن التفاعل الكهروكيميائي كان قابلا للانعكاس بناء على فصل الذروة. تم حساب مساحة السطح النشطة للأقطاب الكهربائية المعدلة على أنها 0.26 سم مربع و 0.41 سم مربع للقطب العاري والقطب المعدل ، على التوالي. أكدت هذه النتيجة أن التحسن الذي أحدثته جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك على مساحة السطح النشطة كان أعلى نسبيا مقارنة بالقطب العاري.

قيمة مقاومة نقل الشحنة للقطب العاري 1 ، 932 أوم ، بينما انخفض القطب المعدل إلى 1 ، 444 أوم. قد يكون انخفاض قيمة مقاومة نقل الشحنة في القطب المعدل ناتجا عن انخفاض في ثابت العزل الكهربائي المحلي و / أو زيادة في سمك الطبقة الكهربائية المزدوجة ، مما يشير إلى أن فيروسيانيد البوتاسيوم يعمل عن طريق الامتصاص في السطح البيني للمعدن أو المحلول. زادت تيارات الذروة تدريجيا مع تعديل القطب العاري باستخدام جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك والتي أظهرت أن الحساسية الأعلى كانت معكوس مقاومة نقل الشحنة المنخفضة.

تم اشتقاق الانحراف المعياري النسبي للقطب المعدل على أنه 4.26٪ أعطى القطب الكهربائي مع تعديل جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك انحرافا معياريا نسبيا أفضل بعد عدة قياسات. قيم الانحراف المعياري النسبي 4.05٪ للقطب المعدل تشير إلى قابلية أفضل للتكاثر لتصنيع القطب الكهربائي لجزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك. كان التركيز الأمثل للحمض النووي 1.2 ميكرومولار من الحمض النووي أحادي الشريط.

تم اختيار وقت الشلل الأمثل للحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل على أنه 180 دقيقة. تم اختيار درجة حرارة الشلل المثلى للحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل على أنها 55 درجة مئوية. تم اختيار وقت التهجين الأمثل للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل على أنه 10 دقائق.

تم اختيار درجة حرارة التهجين المثلى للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل على أنها 35 درجة مئوية. أظهر الحمض النووي التكميلي أدنى ذروة تيار يبلغ 0.73 ميكروأمبير بين الحمض النووي الذي تم فحصه ، والحمض النووي غير التكميلي ، وثلاث قواعد غير متطابقة من الحمض النووي ، وقاعدة واحدة غير متطابقة من الحمض النووي. من الواضح أن التيار العالي من الحمض النووي الذي تم استهدافه أصغر من تيار التسلسلات الأخرى من قليل النوكليوتيدات.

أشارت هذه النتيجة إلى أنه يمكن استخدام المستشعر الحيوي للتمييز بحساسية وخصوصية عالية. كان للمستشعر الحيوي للحمض النووي الذي تم إنشاؤه انتقائية للكشف عن التهجين عبر الحمض النووي للمسبار الثابت على سطح القطب المعدل تم تشغيل الانخفاض المستمر في ذروة قياس النبض التفاضلي لتيار الميثيلين الأزرق على القطب المعدل نتيجة لزيادة تركيز الحمض النووي التكميلي.

تصوير ارتباط خطي بين سجل تركيزات الحمض النووي المستهدفة المختلفة من 0.2 بيكومولار إلى 0.02 ملليمولار وسجل تيار ذروة الاختزال الأزرق الميثيلين بمعامل انحدار خطي قدره 0.96. انخفضت النسبة المئوية لاسترداد المستشعر الحيوي للحمض النووي المصنع ببطء إلى ما لا يقل عن 80٪ من إشارته الأولية بعد ستة أشهر من التخزين ، مما يشير إلى أن مسبار الحمض النووي الفردي الذي تقطعت به السبل على سطح القطب المعدل مستقر للغاية. قد يكون الاستقرار الجيد على المدى الطويل عند درجة حرارة أقل من 45 درجة مئوية هو سبب التفاعل القوي بين جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك والحمض النووي أحادي الشريطة.

فحص منتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسعة أنواع مختلفة من البكتيريا ، وهي Bacillus cereus و Listeria monocytogenes و Campylobacter jejuni و Escherichia coli و Vibrio alginolyticus و Salmonella typhimurium و Salmonella Enteris و Klebsiella pneumoniae و Vibrio parahaemolyticus. يظهر تيار ذروة قياس الفولتامتر النبضي التفاضلي الذي تم الحصول عليه بعد تقييم التفاعل المتبادل اكتشافا واضحا جدا ل Vibrio parahaemolyticus مقارنة بأنواع البكتيريا الأخرى. يمكن رؤيته من خلال تقليل عدد أزواج القواعد ، تزداد إشارة قياس الجهد النبضي التفاضلي المرصودة.

يرتبط هذا بالكمية الأكبر من جزيئات الميثيلين الزرقاء وصولا إلى المجسات. من تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم العثور على Vibrio parahaemolyticus في كل من العينات المسننة المعالجة وغير المعالجة ، كما هو موضح في الممرات السابعة والثامنة والتسعة و10 و 11 و 12. في حين أن العينات المعالجة وغير المعالجة غير المسننة في الممر الأول والثاني والثالث والرابع والخامس والسادس كانت خالية من الضمة parahaemolyticus.

نتائج الكشف باستخدام المستشعر الحيوي للحمض النووي المطور الذي نجح في تحديد وجود Vibrio parahaemolyticus في المجموعة المعالجة المكونة من عينات مسننة وغير مسننة. ترتبط هذه النتائج بشكل إيجابي بنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تمت مناقشتها سابقا. إن تطبيق جزيئات الذهب النانوية المستقرة بحمض اللاكتيك لديه إمكانات كبيرة للتطبيق كتعديل لمزيد من الإحساس بالتصنيع.

يمكن تحقيق انتقائية عالية عندما يرتبط مركب الأكسدة والاختزال بقوة أكبر بجزيء التعرف الحيوي غير المهجن ، والذي قد يكون ابتكارا يستحق المتابعة.