طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير ظروف موحدة لتعقيم البذور بنجاح لعدد كبير من الأنماط الجينية لأرابيدوبسيس مع منع نمو الميكروبات. تسمح لك هذه الطريقة بتعقيم مئات عينات البذور في وقت واحد ، وبالتالي تبسيط خطوة تحضير المواد النباتية الحرجة في مجالات علم الجينوم والبروتينات والتمثيل الغذائي وغيرها من الدراسات عالية الإنتاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر ظروفا يتم فيها الجمع بين التعقيم الفعال ومعدل إنبات مرتفع لعدد كبير من عينات البذور.

للبدء ، قم بإعداد محلول مبيض بنسبة 50٪ بالماء المقطر. لكل 200 مل من محلول التبييض ، أضف 50 ميكرولتر من منظف TWEEN 20. يمكن تخزين محلول التبييض لمدة تصل إلى شهر طالما أنه مفتوح فقط في ظروف معقمة.

بعد ذلك ، قم بنقل 100 بذرة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. يمكن القيام بذلك يدويا ، أو باستخدام روبوت بذور مخصص. الآن ، في غطاء التدفق الصفحي ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التبييض بنسبة 50٪ إلى البذور.

بعد ذلك ، انقل الأنابيب إلى دوار واحتضان البذور في المبيض مع تحريض خفيف لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بشفط محلول التبييض من الأنابيب وإزالة أكبر قدر ممكن. ثم أضف 500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم واقلب الأنابيب للخلط.

اترك البذور تستقر ، ثم استنشق الماء واستبدله بقطعة أخرى لغسل البذور مرة أخرى. قم بإجراء ما مجموعه ستة غسلات بالماء المقطر المعقم. بمجرد غسل البذور جيدا بالماء ، قم بتعليقها في ملليلتر واحد من الماء قبل طلاءها.

قبل البدء في عملية التعقيم ، احسب أحجام المبيض وحمض الهيدروكلوريك المطلوبة لإنتاج غاز الكلور. استخدم المعادلة المقدمة للحصول على غاز الكلور الموصى به بنسبة 6٪. تأكد من حساب حجم حمض الهيدروكلوريك المطلوب بدقة لضمان التعقيم الناجح ومنع تناثره.

تأكد من ارتداء القفازات ومعطف المختبر أثناء هذا البروتوكول وتغيير القفازات كلما تم ترطيبها بالحمض أو المبيض. تحت غطاء الدخان ، انقل قوارير البذور إلى رف مع فتح أغطيةها. بعد ذلك ، ضع الرف في وعاء بلاستيكي يمكن أن يتم فيه التعقيم وقم بإعداد شرائط فيلم البارافين لإغلاق الغطاء بالحاوية.

الآن ، قم بتحميل الدورق ب 100 مل من المبيض ثم ضع دورق سعة 250 مل بالداخل. يعد استخدام فائض من مواد التبييض ميزة أمان ويجب أن يكون الدورق ضعف الحجم الإجمالي للمحلول الذي يحتوي عليه على الأقل. أيضا ، تعامل دائما مع المبيض والأحماض بشكل منفصل.

بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك إلى الدورق ، ثم أغلق الحاوية على الفور وأغلقها بالبارافيلم. راقب الحاوية لمدة ساعة واحدة للتأكد من تراكم الغاز أثناء التعقيم. يجب أن يكون غاز الكلور مرئيا على شكل ضباب أصفر باهت داخل الحاوية أو يمكن فحص المحلول لتحوله إلى اللون الأصفر.

تحقق بشكل دوري من الختم الموجود على الحاوية. إذا تم فك الغطاء أو بدأ ختم البارافين في الارتخاء ، فأعد إغلاق الغطاء بإحكام بطبقة إضافية من فيلم البارافين. بعد التعقيم لمدة ساعة واحدة ، افتح ركنا من الحاوية لتنفيس الغاز على مدى ثلاث ساعات.

بعد ثلاث ساعات من التنفيس ، قم بتغطية جميع الأنابيب وتخزين البذور المعقمة في ظروف جافة حتى يتم طلاءها. الآن ، قم بتحييد التفاعل عن طريق إضافة 1.5 جرام من مسحوق بيكربونات الصوديوم ببطء مع التقليب بقضيب زجاجي لإذابة المواد الصلبة. استمر في إضافة بيكربونات الصوديوم حتى تتوقف فقاعات غاز ثاني أكسيد الكربون عن التكون.

بعد ذلك ، قم بقياس درجة الحموضة في المحلول ، وإذا لزم الأمر ، أضف بيكربونات الصوديوم الإضافية حتى يصبح الرقم الهيدروجيني محايدا. شريطة ألا يكون المحلول كريه الرائحة ، يمكن التخلص منه. خلاف ذلك ، انتظر حتى تتبدد كل الروائح.

أضف 500 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى كل أنبوب من البذور المعقمة بالغاز. بعد ذلك، اسكب البذور على طبق مرض التصلب العصبي المتعدد ووزعها بالتساوي باستخدام حلقة تلقيح معقمة تستخدم مرة واحدة أو طرف ماصة معقمة. بعد ثلاثة أيام من التقسيم الطبقي للبذور عند أربع درجات مئوية ، انقل الصفائح إلى 23 درجة مئوية مع 16 ساعة من التعرض اليومي للضوء.

احتفظ بالأغطية في الأعلى حتى تنمو الجذور إلى الوسط. بعد ثمانية أيام من النمو ، سجل جزء البذور التي نبتت. يتم حساب الإنبات عندما يكون الجذر قد سقط خارج طبقة البذرة ، وتكون الفلقات مرئية.

أيضا ، احسب عدد البذور المصابة بالعفن لتحديد فعالية ظروف التعقيم. تم اختبار أربعة تركيزات مختلفة من التبييض في خمس أوقات تعرض مختلفة على بذور كولومبيا البرية. أثرت تركيزات التبييض العالية سلبا على الإنبات مع التعرض المفرط.

ومع ذلك ، لوحظت معدلات إنبات عالية مع 40 و 50٪ من التبييض في جميع أوقات التعرض. كانت البذور المعقمة بتركيزات عالية من التبييض ذات معدل وفيات مرتفع وغالبا ما تظهر عيوبا في النمو ولكنها عادة ما تكون خالية تماما من العفن. تم تحديد التعقيم بواسطة 50٪ من المبيض لمدة 10 دقائق للحصول على التوازن الأمثل بين تثبيط العفن والإنبات الصحي.

لتحسين ظروف تعقيم غاز الكلور ، تم استخدام ثلاثة تركيزات مختلفة من غاز الكلور لتعقيم بذور كولومبيا البرية على مدى فترتين مختلفتين من الزمن. كان هناك تفاعل كبير بين الوقت وتركيز الغاز. في ساعة واحدة ، لم يكن هناك أي تأثير على الإنبات ، في حين أن أعلى تركيز للغاز كان ضارا بعد ثلاث ساعات.

وهكذا ، تم اختيار فترة تعقيم مدتها ساعة واحدة. تم منع نمو العفن بشكل فعال عن طريق التعرض للغاز لمدة ثلاث ساعات أو للتعرض لمدة ساعة واحدة باستخدام ستة أو 17٪ من الغازات. وبالتالي ، تم تحديد تركيز غاز 6٪ لمدة ساعة واحدة ليكون مثاليا للإنبات وتثبيط العفن.

بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتعقيم مئات خطوط البذور بنجاح يوميا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يمكن أيضا تخزين البذور المعقمة بالغاز لفترة طويلة من الزمن في الظروف الجافة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام المعادلات المقدمة لحساب الأحجام المطلوبة من حمض الهيدروكلوريك والتبييض.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل دراسات الارتباط على مستوى الجينوم من أجل ربط مجموعة متنوعة من الأنماط الجينية المختلفة والأنماط الظاهرية ذات الأهمية. حظا سعيدا في تجاربك.