مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة

الهدف العام من هذا الاختبار البسيط القائم على التألق هو فحص المكونات الخلوية المطلوبة للاتجار السليم بسم الريسين A أو سلسلة RTA في الكائن الحي النموذجي للخميرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بالنقل بين الخلايا للريبوسوم في تنشيط السم الب. في حالتنا ، الوحدة الفرعية السامة للخلايا من مادة الريسين السامة من غشاء البلازما إلى الجسيم الخلوي.

الميزة الرئيسية لهذا الاختبار هي فرصة تحليل تأثير جين الخميرة الفردية على نقل هيئة الطرق والمواصلات بطريقة سريعة وغير مكلفة. ابدأ هذا البروتوكول بتحويل الخلية كما هو مفصل في بروتوكول النص. تلقيح خمسة ملليلتر من وسط LB kanamycin بخلايا تحتوي على بلازميد تعبير RTA أو ناقل فارغ.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. استكمل لترا واحدا من وسط LB kanamycin بخمسة ملليلتر من الزراعة المسبقة. ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة حتى تصل الخلايا إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.8 إلى 1.0.

بعد ذلك ، قم بخفض درجة حرارة الثقافة إلى 28 درجة مئوية. تحفيز التعبير RTA عن الإشريكية القولونية عن طريق إضافة IPTG إلى التركيز النهائي البالغ ملليمولول واحد. بعد 3.5 ساعة عند 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 10،000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

ثم اغسل الحبيبات بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم والحبيبات عند 10, 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. بعد تكرار الغسيل مرة واحدة ، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم. قم بتوصيل الخلايا على الجليد باستخدام خمس دورات من نبضة مدتها 15 ثانية وتوقف مؤقت لمدة 30 ثانية.

بعد الطرد المركزي للخلية عند 21 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، قم بتصفية المادة الطافية باستخدام نظام مرشح حقنة معقمة. استخدم نظام تنقية آلي ، مزود بعمود تقارب قائم على النيكل بسعة خمسة ملليلتر لتنقية جزء هيئة الطرق والمواصلات الموسوم ب HIS من المطحنية المطفية المعقمة المفلترة. بشكل عام ، استخدم سرعة تلميح تبلغ ملليلتر واحد في الدقيقة وقم بتبريد نظام التنقية بالكامل لمنع ارتباط السموم غير الفعال وفقدان نشاط السموم.

قم بموازنة عمود التقارب لفترة وجيزة مع 20 مل من المخزن المؤقت للربط لإزالة المخزن المؤقت للتخزين. ثم ضع المادة الطافية المعقمة المفلترة على عمود التقارب باستخدام حقنة. اغسل العمود ب 25 إلى 35 مل من المخزن المؤقت الملزم لإزالة البروتينات غير المرتبطة من العمود.

قم بتنفيذ خطوة الغسيل حتى تقترب المواد الماصة للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر من قيمة الأشعة فوق البنفسجية الأولية. ثم قم بمسح جزء RTA المرتبط ب 20 إلى 35 مل من المخزن المؤقت للشطف واحتفظ بالعينة على الجليد. من المهم بدء أخذ عينات كسر هيئة الطرق والمواصلات بعد فترة وجيزة من زيادة قيمة الأشعة فوق البنفسجية 280 وإيقاف أخذ عينات جزء هيئة الطرق والمواصلات عندما يصل إلى خط الأساس الأصلي مرة أخرى.

لتحلية جزء RTA المراوغ ، استبدل عمود التقارب في نظام التنقية بعمود التحلية وقم بموازنة العمود ب 20 مل من 0.8 مولي السوربيتول. قم بتطبيق كسر RTA الذي تم مراغته على العمود عبر حقنة. اغسل العمود ب 100 مل من 0.8 مولار السوربيتول وقم بتخفيف جزء RTA المحلى في أنبوب سعة 15 مليلتر بمجرد أن يبدأ امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في الزيادة.

لتجنب تلوث الملح ، توقف عند أخذ عينات الكسر مباشرة عند زيادة التوصيل. قم بتخزين جزء RTA المراوغ عند أربع درجات مئوية. بعد تحويل الخميرة كما هو موضح في بروتوكول النص ، اختر ثلاثة نسخ مختلفة من الخميرة من كل لوحة.

تلقيح المستنسخة في 100 مل من وسط رافينوز اللوسين عند 220 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 1.0 إلى 2.0. الطرد المركزي للخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق عند 10،000 جم. بعد غسل الخلايا مرتين بخمسة ملليلتر من الماء المعقم ، أعد تعليق الخلايا في 50 مل من العازلة

احتضان مزرعة 50 مل عند 100 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الطرد المركزي عند 400 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، اغسل الخلايا مرتين بخمسة ملليلتر من وسط الرافينوز المستقر للوسين. ثم أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من نفس الوسط لاستخدام الخلايا مباشرة لقياسات فحص مراسل GFP.

قم بزرع خلايا الخميرة في 96 لوحة بئر. إلى كل بئر ، أضف 70 ميكرولترا من وسط الرافينوز الراسخ المستقر ، الذي يحتوي على التحكم السلبي ، معبرا عن المتجه الفارغ أو RTA المنقى في تركيز RTA النهائي البالغ خمسة ميكرومولار. أضف 70 ميكرولترا من وسط تسرب اللوسين المستقر إلى كل بئر من الآبار المتبقية ليصل حجمها الإجمالي إلى 270 ميكرولترا.

للتحكم الإيجابي في تثبيط البروتين ، أضف 70 ميكرولترا من محلول G418 المستقر 0.8 مولار ، حيث يمنع G418 تعبير GFP في الخميرة. أضف على الفور 30 ميكرولترا من محلول الجالاكتوز المستقر للحث على تعبير GFP. قم بإعداد عنصر تحكم سلبي إضافي عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من وسط الرافينوز المستقرة بدلا من 30٪ جالاكتوز.

بعد الانتهاء من تحضير العينة ، ضع لوحة البئر 96 في قارئ مضان واستعد للقياس باستخدام مجموعة المرشح 475 ، 509 نانومتر المطلوبة للكشف عن مضان GFP. قم بإجراء القياسات عند 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة وقطر اهتزاز ملليمتر واحد على مدى فترة زمنية مدتها 20 ساعة بفواصل زمنية مدتها 10 دقائق. يظهر هنا رسم بياني تمثيلي لتنقية كروماتوغرافيا التقارب في RTA والتحكم في المتجهات الفارغة.

تمثل الذروة الزرقاء في المربع الأسود كسر RTA المقيد. كما هو موضح في الصندوق الأسود ، لا يتم استخلاص أي بروتينات من العمود في عنصر التحكم السلبي. يظهر هنا مخطط تحلية لجزء RTA منقى التقارب.

يوضح الرسم البياني فصل جزء بروتين RTA وجزء الملح. تظهر نتائج تلطيخ Coomassie بعد التنقية والتحلية الناجحة عينات محللة خلية أو عينات منقاة من متغيرات مختلفة من هيئة الطرق والمواصلات. تم استخدام RTA غير معدل في هذه الدراسة.

للتحقق من صحة مقايسة المراسل المتباعدة الفلورية ، تم قياس التألق النسبي للخميرة الكروية من النوع البري في ظل ظروف مستحثة وغير مستحثة بعد 20 ساعة من تحريض GFP. كما تم تحليل مضان GFP النسبي في وجود RTA أو G418 أو التحكم السلبي. تم قياس التألق النسبي ل GFP أيضا للطفرات المختارة التي من المعروف أن البروتينات المقابلة متورطة فيها ولا تشارك في تجارة هيئة الطرق والمواصلات في الخميرة.

يمثل الخط المنقط عتبة أهمية. بمجرد إتقان تعبير هيئة الطرق والمواصلات والتنقية ، يمكن تلقي نتائج اختبار تقرير التألق في يوم واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين في مجال تعطيل الريبوسوم للسموم البائية لدراسة جذورها التسمم في خميرة كائن حي حقيقي النواة.