تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد

الهدف العام من هذا البروتوكول هو دراسة الاتصال المباشر وغير المباشر بين خلايا سرطان الثدي الأولية والخلايا الوحيدة في نظام زراعة مشتركة ثلاثي الأبعاد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيئة المكروية الالتهابية لمجال سرطان الثدي مثل كيفية إعادة تصنيف الخلايا المناعية وتنشيطها ، وكيف تساعد هذه الخلايا في الحفاظ على البيئة المكروية الالتهابية للورم وكيف تسهل هذه البيئة المكروية غزو الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر بديلا ميسور التكلفة لدراسة الاتصال داخل الورم وتوضح إمكانات أنظمة الخلايا ثلاثية الأبعاد في المختبر لاستجواب سمات محددة لبيولوجيا الورم.

خاصة تلك المتعلقة بعدوان الورم. للبدء ، قم بزراعة مرتين 10 إلى الخلايا الوحيدة السادسة U937 و THP1 في 10 ملليلتر من وسط RPMI1640 ، مع استكمال 10 في المائة FBS ومضادات حيوية واحدة بالمائة مضاد للفطريات. قم أيضا بزراعة PMs الطازجة في وسط DMEMF12 مكمل.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. لوحة أربعة أوقات 10 إلى ال [مونوسيت] خامسة في واحدة مليلتر لكل بئر من الوسط المقابل لها. ضع إدخالا في كل بئر وأضف 900 ميكرولتر من أربعة أضعاف 10 إلى تعليق خلية BrC الخامس في الوسط المقابل.

احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة خمسة أيام واسترجع المواد الطافية. استرجع الخلايا عن طريق التربسينية إذا تم إجراء التحليل اللاحق. قم بتضمين عناصر التحكم في مزارع الخلايا الفردية مع الوسائط المعنية.

لتسمية خلايا BrC والخلايا الوحيدة بالكومرين والرودامين المتاحين تجاريا قبل زراعة الخلايا ، قم بإعداد طبقة أحادية من اثنين في 10 إلى خلايا BrC السادسة ذات الأهمية واستبدل الوسط القياسي بمحلول عمل كاف ودافئ مسبقا لصبغة الفلورسنت. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم استنشق محلول الصبغة واستخدم ما يكفي من XPBS لشطف الخلايا برفق.

استنشق PBS وأضف الوسيط القياسي. لتربسين الخلايا ، أضف ملليلترين من 05 في المائة من التربسين و 0.48 مللي مولار EDTA إلى القارورة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من FBS لوقف التربسين وسبعة ملليلتر من الوسط المقابل بدون مكملات غذائية.

أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة ، ثم انقل 10 ميكرولترات من الخلايا إلى غرفة Nuebauer وعدادها. بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا عند 430 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية واستخدم ثلاثة ملليلتر من محلول عمل صبغة الفلورسنت الدافئ مسبقا لإعادة تعليق الخلايا. احتضان معلق الخلية عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة.

بعد تكوير الخلايا مرة أخرى ، تخلص من محلول عمل الصبغة واستخدم خمسة إلى سبعة ملليلتر من XPBS لإعادة تعليق الخلايا برفق. بعد ذلك ، بعد تكوير الخلايا مرة أخرى والتخلص من PBS ، أعد تعليق الخلايا في خمسة إلى سبعة ملليلتر من الوسط القياسي. عد 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.

قم بإعداد ثقافة مشتركة عن طريق نشر ما يكفي من ECME في قاع البئر لتشكيل طبقة متساوية في كل بئر من نظام الشرائح المكون من أربع غرف آبار. لوحة 20 ميكرولتر من معلق خلية واحدة تحتوي على خمس مرات 10 إلى خلايا BrC الخامسة المسماة لكل بئر. بعد 15 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أضف تعليقا 2.5 في 10 إلى الخلايا الوحيدة الخامسة المسمى في 80 ميكرولترا من وسط الفحص المكمل بنسبة 60 بالمائة من ECME.

اسمح ل ECME بالتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. أضف الآن ملليلترا واحدا من خليط واحد إلى واحد من خلايا BrC ووسط زراعة الخلايا الأحادية. احتضان المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو خمسة أيام لتتبع التغييرات في نقاط زمنية مختلفة.

لتحلل بروتينات ECM واستعادة الخلايا من الثقافات ، قم بشفط الوسط والتخلص منه ، ثم أضف 0.5 مل من XPBS واحد مع 0.1 في المائة من التربسين و 0.25 في المائة EDTA إلى الثقافة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة ، أضف 0.5 مل من XPBS واحد مع 10 في المائة FBS لتحييد التربسين وإعادة تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات بقوة للحصول على تعليق خلية واحدة.

بعد تكوير الخلايا ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من XPBS واحد مع 10 بالمائة FBS. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. إخضاع تعليق الخلية للفاكس باستخدام الأداة المناسبة.

تأكد من أن المجموعات النهائية نقية بنسبة 95 في المائة على الأقل. في كل بئر من نظام انزلاق غرفة الآبار الثماني ، انشر قاعدة 40 ميكرولتر من ECME واتركها تتصلب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بذرة 800 MCF10 خلية A لكل بئر في 400 ميكرولتر من وسط استزراع DMEM F12 المكملم وفقا لبروتوكول النص.

ثم أضف 400 ميكرولتر من وسط مكيف أو وسط استزراع DMEM F12 المكمل مع 20 نانوغرام لكل مليلتر من بيتا IL1 المؤتلف البشري. ضع شريحة الغرفة في طبق بتري زجاجي يحتوي على طبق بتري سعة 35 مليلتر مملوء بملليلترين من PBS. يجب زرع خلايا MCF 10A في كل بئر ببطء شديد لتجنب تلف قاعدة ECME ولمنع الخلايا من الاستقرار وتشكيل أحادي.

باستخدام المجهر البصري ، قم بتسجيل تكوين الأسيني الغدي كل 24 ساعة لمدة 14 يوما. بعد 14 يوما من الثقافة ، أضف 100 ميكرولتر من 100 نانومولار دابي في XPBS واحد واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة مع التحريك المستمر لمدة 25 دقيقة. اشطف العينات ب XPBS واحد في درجة حرارة الغرفة ، ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع التحريك المستمر.

استخدم وسيط التركيب الخاص بتلطيخ الفلورسنت لتركيب المستحضرات. ثم قم بإغلاق العينات المثبتة بتلميع شفاف والحفاظ على الشرائح المحمية من الضوء عند أربع درجات مئوية. سيوضح الإجراء في المجهر متحد البؤر فاديم بيريز ، الباحث من المختبر الوطني للتنقيب المجهري المتقدم.

قم بتحليل الأسيني باستخدام مجهر متحد البؤر لالتقاط صور لأكوام عرضية على أعماق مختلفة من الأسيني. تصور البروتينات الخلوية المختلفة في الأسيني باستخدام بروتوكولات التلوين المناسبة. على سبيل المثال ، تم تلطيخ الكاهيرين هنا لتقييم التصاق الخلية إلى الخلية ، وقطبية الخلية ، وتكوين الفم.

تمت دراسة مورفولوجيا خلايا BrC الأولية التي تنمو في الثقافات ثلاثية الأبعاد بكثافات منخفضة وعالية على مدى خمسة أيام. خلال ال 48 ساعة الأولى ، تلتصق الخلايا ب ECME بشكل مغزل ممدود وتشكل هياكل تشبه الحياكة في خمسة أيام. بعد خمسة أيام في الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد ، شكلت كل من خلايا BRC التجارية MCF7 و MDA-MB-231 مجاميع غير منظمة.

ومع ذلك ، فإن خلايا MDA-MB-231 العدوانية للركام ذات الأشكال الممدودة ، في حين أن خلايا MCF7 غير العدوانية للمجاميع ذات الأشكال المستديرة التي يتم ضغطها بشكل أكثر كثافة من خلايا MDA-MB-231. تم حصاد المواد الطافية من ثقافات BrC الأولية ثلاثية الأبعاد للتفاعل غير المباشر وثقافاتها المشتركة لمدة خمسة أيام مع الخلايا الوحيدة الأولية. لوحظت زيادة كبيرة في مستويات IL1 بيتا و IL8 في المزارع المشتركة لخلايا وحيدة الخلايا BrC الأولية.

كل من السيتوكينات الحاسمة والملتهبة التي ارتبطت سابقا بتطور الأورام الخبيثة. تمت زراعة خلايا MCF10A باثنين من المواد الطافية المختلفة من خطين أساسيين من خلايا BrC لمراقبة تكوين التجويف كمقياس لمقاومة الأنويكيس. على عكس خلايا MCF10A التي نمت في ظل الظروف القياسية ، فإن الفحص المجهري ثنائي البؤر في اليوم 14 ، تظهر القطع المستعرضة للكرات أن خلايا MCF10A تهربت من anoykis كما تم قياسها عن طريق حساب عدد الخلايا المركزية في الأسيني.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الطبي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. اختبر مسارات الإشارات في كل من هجرة السرطان. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيئات الدقيقة للورم لاستكشاف اتصالات خلايا سرطان الثدي مع الخلايا الكتلية أو الخلايا الليفية أو النيوتروفيلات أو حتى استنساخ مختلفة من الخلايا السرطانية في أنظمة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد لنمذجة البيئة المكروية للورم.