الآثار المتفاوتة للأدوية الخافضة للدهون في تحوير مورفولوجيا جزيئات الكوليسترول

الهدف العام من هذه الدراسة هو تقييم تأثير الأدوية الخافضة للدهون في تعديل السمات المورفولوجية لجزيئات الكوليسترول باستخدام طريقة مصفوفة البلاك ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة لتشخيص تصلب الشرايين وتحديد تأثيرات الأدوية. دور الأدوية الخافضة للدهون في تعديل تكوين جزيئات الكوليسترول غير مفهوم جيدا. نوضح هنا أن الأدوية الخافضة للدهون تلعب دورا مباشرا في تغيير الملامح والسمات المورفولوجية لتكوين جزيئات الكوليسترول.

تتمثل الميزة الرئيسية لمصفوفة البلاك القائمة على طريقة التصوير في المختبر على طرق الكشف عن الجسيمات الأخرى في أنها تتيح تصور جزيئات الكوليسترول لتقييم تأثير الأدوية الخافضة للدهون في المصل. سيوضح جيسون لوندري ، فني المختبر في Plaxgen كيف قمنا بإعداد مقايسة مصفوفة البلاك باستخدام محلل الكيمياء. سيوضح ريموند كونغ ، كبير العلماء في Millipore Sigma ، كيفية قيامنا بمعالجة العينات باستخدام قياس تدفق التصوير.

أخيرا ، سيوضح ديفيد ليو ، فني المختبر في Plaxgen تحليل البيانات لصور جزيئات الكوليسترول. استخدم محلل الكيمياء -1 لإعداد مقايسة مصفوفة البلاك لتكوين جزيئات الكوليسترول. خلال الفحص ، حافظ على حجم التفاعل النهائي في كل بئر عند 200 ميكرولتر ، وقم بإجراء جميع المقايسات بثلاث نسخ.

أولا ، قم بتحميل 194 نقطة خمسة ميكرولترات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PDS إلى كل بئر من قاع دائري ، لوح 96 بئر منخفض البروتين. إلى كل بئر ، أضف نقطتين وخمسة ميكرولتر من كل محلول دواء لخفض الدهون ، ولا يضاف أي دواء إلى عينات التحكم السلبية. بعد ذلك ، رج اللوحة لمدة 30 ثانية ، عن طريق وضعها على لوحة تفاعل محلل الكيمياء -1 لخلط الدواء بشكل موحد في المحلول.

أخيرا ، أضف ميكرولترين من محلول الكوليسترول الكلي المسمى بالفلورسنت إلى كل بئر. رج اللوحة لمدة 30 ثانية عن طريق وضعها على لوحة تفاعل محلل الكيمياء -1 كما كان من قبل. بعد ذلك ، احتضن اللوحة على شاكر المختبر لمدة ساعتين مضبوطا على 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، احصل على صور الجسيمات عن طريق تصوير قياس التدفق الخلوي. افتح قالب الحصول على البيانات لتحميل إعدادات الجهاز الصحيحة. انقر على ملف، ثم حدد تحميل القالب وحدد ملف القالب.

انقر فوق تحميل ، لإعداد الجهاز لتحميل العينة. عند فتح مربع الحوار تحميل العينة، انقر فوق موافق لتحميل 50 ميكرولتر من العينات في مقياس تدفق التصوير. انتظر حتى يمكن رؤية الجسيمات في منطقة التصوير في الوقت الفعلي.

عندما تكون الجسيمات الموجودة في منطقة التصوير في تركيز بؤري جيد، انقر فوق اكتساب للحصول على صور لكل كائن في وقت واحد بطريقة عالية الإنتاجية للمجال المظلم والمجال الساطع والتألق الأخضر والفلورة الصفراء. في نهاية عملية الاستحواذ، انقر على زر الإرجاع لإرجاع العينة. كرر هذه الخطوات للحصول على 5,000 إلى 10,000 جسيم من كل عينة.

قم بتحليل جميع ملفات الصور الأولية باستخدام برنامج تحليل الصور لتحديد شدة مضان الكائن والاختلافات المورفولوجية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإعداد صفيحة بئر 96 منخفضة البروتين ذات القاع المستدير عن طريق تحميل الكواشف بطريقة تدريجية ، باستخدام حجم تفاعل نهائي يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر. أولا ، قم بإعداد آبار التحكم.

قم بتحميل 193 ميكرولتر من PBS لكل بئر. أضف 2.5٪ من مصل المريض ، وقم بتحميل عينة مصل واحدة فقط لكل بئر. ثم قم بهز اللوحة لمدة 30 ثانية عن طريق وضعها على لوحة تفاعل محلل الكيمياء.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من محلول الكوليسترول الكلي المسمى بالفلورة في كل بئر. مرة أخرى ، رج اللوحة لمدة 30 ثانية عن طريق وضعها على لوحة تفاعل محلل الكيمياء -1. لتحضير الآبار بالأدوية ، قم بتحميل 191 ميكرولتر من PBS في كل بئر.

ثم أضف 2.5٪ من كل مصل مريض لكل بئر ، ورج اللوحة لمدة 30 ثانية ، عن طريق وضعها على لوحة تفاعل محلل الكيمياء -1. أضف ميكرولترين من محلول الإزيتيميب أو اللوفاستاتين أو سيمفاستاتين أو النياسين إلى جميع الآبار باستثناء آبار التحكم السلبية. إضافة دواء واحد فقط لكل بئر.

استمر في هز الطبق لمدة 30 ثانية كما كان من قبل. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من محلول الكوليسترول الفلوري المسمى في كل بئر قبل رج الطبق لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، احتضن اللوحة لمدة ساعتين في شاكر المختبر ، على 37 درجة مئوية ، و 200 دورة في الدقيقة.

بعد الحضانة ، احصل على العينات عن طريق تصوير قياس التدفق الخلوي باتباع نفس الإعدادات كما كان من قبل. استخدم برنامج تحليل الصور لمعالجة جميع ملفات الصور دفعة واحدة كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا نتائج تمثيلية توضح تحديد جزيئات الكوليسترول الكروية والخطية على شكل خيط ، والتي تسببها العقاقير المخفضة للكوليسترول ، بواسطة آلية غير إنزيمية.

يظهر تأكيد لشكلين متميزين لتكوين جزيئات الكوليسترول ، الناجمة عن أدوية أخرى لخفض الدهون. بما في ذلك إزيتيمايب والنياسين والفيبرات وأحماض أوميغا 3 الدهنية. تظهر هنا مخططات نقطية ، حيث يعرض المحور X طيفا من جزيئات الكوليسترول المكتشفة في قناة التألق الأخضر.

ويعرض المحور Y التشتت الجانبي ، وتظهر البوابات مناطق من البروتين الدهني منخفض الكثافة ، والبروتين الدهني منخفض الكثافة ، وجزيئات البروتين الدهني عالية الكثافة ، المكتشفة في مخططات النقاط الفلورية. توضح هذه النتائج كيف يغير تأثير خفض الدهون ملامح جزيئات الكوليسترول VLDL و LDL المنقاة ، في حالة عدم وجود دواء ، إيزيميد ، لوفاستاتين ، سيمفاستاتين ونياسين. تظهر هنا شاشة من ثلاث عينات مختلفة من المصل لتحديد التأثير التفاضلي لمختلف أدوية خفض الدهون ، والتي تعدل ملامح تكوين جزيئات الكوليسترول VLDL و LDL و HDL.

تشير هذه الملامح إلى وجود اختلاف في مستويات الاستجابة بين عينات المصل الثلاث المختلفة. يؤكد فحص عينة المصل الأولى لجزيئات الكوليسترول الكروية والخطية التي تشكلت بدون الدواء وفي وجود أدوية مختلفة لخفض الدهون ، شكلين متميزين لجزيئات الكوليسترول المشتقة من المصل ، ويعرضان أشكال خيوط كروية وخطية. لذلك نجحنا في إثبات نهج التصوير في المختبر لتحديد تأثير الدواء الخافض للدهون ، والذي يعدل العلاقة بتكوين جزيئات الكوليسترول وأهميتها السريرية.

نتائجنا الأولية واعدة ، ونحن بصدد التحقق من صحة مقايسة مصفوفة البلاك هذه باستخدام عينات سريرية واسعة النطاق. تقيس لوحة الدهون القياسية مستويات كوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة وكوليسترول البروتين الدهني عالي الكثافة في المصل. يأمل اختبار مجموعة البلاك الخاص بنا في تحسين دقة خطر تصلب الشرايين ويتنبأ بالاستجابة الدوائية لخفض الدهون باستخدام المصل.