طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين
ديسمبر 21, 2017
ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو تسمية النصوص الفردية في الإشريكية القولونية لتحقيقات الحمض النووي المصنفة فلورسنت للتصور في تجارب FiSH أحادية الجزيء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الأنظمة ، مثل توصيف النصوص من خلية إلى خلية قدرة مجال الاهتمام. بالإضافة إلى نصوص توطين جدار الخلية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر كمية من المعلومات حول إحصائيات عمليات النسخ. لبدء البروتوكول ، قم بزراعة الإشريكية القولونية MG1655 في وسط LB بين عشية وضحاها في شاكر مداري ، عند 260 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة الليلية عند واحد إلى 100 في وسط جديد وقياس كثافتها البصرية في مقياس الطيف الضوئي ، حتى قيمة 0.2 إلى 0.4.
بعد ذلك ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 4 ، 500 جم عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية من جميع الأنابيب. أضف ملليلتر واحد من 1XPBS إلى كل أنبوب وأعد تعليق الحبيبات لتقليل تراكم الخلية إلى الخلية.
ثم أضف أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتثبيت وقم بدوامة الأنبوب برفق. احتضان العينات في شاكر مداري. أعد تعليق الحبيبات لتقليل التراكم من خلية إلى خلية, مما قد يتداخل مع تصوير الخلية.
بعد الحضانة ، قم بتكسير الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وأضف ملليلتر واحد من 1XPBS. نقل المعلقات إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة القاع المخروطي سعة 1.8 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
ابدأ نفاذية البكتيريا عن طريق إزالة المادة الطافية بعناية. استخدم ماصات صغيرة الحجم لإزالة كل السائل خارج الحبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من المياه المعالجة DEPC.
أضف 350 ميكرولتر من الإيثانول المطلق عالي الجودة واخلط المحلول برفق عن طريق قلب الأنبوب. أضف 350 ميكرولترا أخرى من الإيثانول واخلطها مرة أخرى. ثم قم بتدوير العينة باستخدام محور دوار الأنبوب عند 20 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
بيليه الخلايا من النفاذية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية. أضف ملليلتر واحد من 20٪ مخزن غسيل إلى العينات.
اتركهم واقفين لعدة دقائق. بعد ذلك ، خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة سبع دقائق عند 750 جم وأربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية برفق شديد واستخدم ماصات صغيرة الحجم لإزالة كل السائل خارج الحبيبات.
ثم أضف محلول مخزون مجموعة مسبار قليل النوكليوتيدات إلى المخزن المؤقت للتهجين بحيث يكون التركيز النهائي للقليل النوكليوتيدات 250 نانومولار ودوامة الأنبوب بقوة. قم بتعليق العينات في 50 ميكرولترا من مخزن التهجين الذي يحتوي على مجسات قليل النوكليوتيدات ، مع تجنب تكوين الفقاعات. اترك العينات طوال الليل ، في الظلام ، على كتلة حرارية عند 30 درجة مئوية.
لتحضير الغسيل ، احصل على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد لكل عينة للتصوير. أضف مخزن غسيل مليلتر واحد لكل أنبوب. أضف 10 إلى 15 ميكرولترا من العينات المهجنة إلى الأنبوب الجديد الذي يحتوي على مخزن الغسيل.
بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم قم بإزالة المادة الطافية. اغسل العينات مرتين أخريين.
أعد تعليق الحبيبات في 25 ميكرولتر المخزن المؤقت للغسيل. قم بإعداد جل الاغاروز عن طريق إضافة 150 ملليغرام من الاغاروز إلى 10 ملليلتر من 2X SSC العازلة. ضعي المحلول في الميكروويف لمدة 10 إلى 15 ثانية في كل مرة ، حتى يذوب الاغاروز تماما.
ثم اترك الأنبوب جانبا ليبرد لبضع دقائق. بعد ذلك ، ضع إطارا منفصلا من السيليكون على الشريحة بحيث يظل مركز الشريحة مكشوفا. ضع حلقة صلبة بعرض 10 ملم ، بسمك واحد إلى ملليمترين في وسط الشريحة.
ضع كمية صغيرة من الجل في المنتصف لإغلاقها وانتظر بضع دقائق حتى يتماسك الجل. ثم أضف المزيد من الجل ، حتى يتم تشكيل شكل قبة عالية. انتظر حوالي 10 دقائق حتى يتماسك الجل ويزيل الحلقة.
ضع 10 ميكرولترات من الخلايا البكتيرية المغسولة على الجل وأغلقها بشريحة انزلاق غطاء صفري. احتفظ بالعينة في الظلام لمنع تبييض الصور. تظهر قياسات smFiSH لخلايا الإشريكية القولونية مستوى تحريض galK استجابة لتركيزات D-fucose المتغيرة خارج الخلية.
يتم عرض إشارة الخلفية بواسطة سلالة محذوفة galK ، أو delta galK JW0740 كعنصر تحكم سلبي. تظهر العديد من البقع في معظم الخلايا. يتوافق مع نسخ galK مفردة أو قليلة عند إضافة اثنين من مليموللار D-fucose إلى الثقافة البكتيرية.
في حين أن بعض البقع تظهر في حالة عدم وجود D-fucose خارج الخلية. مثال آخر لتطبيق هذا البروتوكول يتم توفيره بواسطة جين sodB ، مع صور مضان وتباين طور smFiSH في نوع بري أو سلالة محذوفة JW1648 sodB. يمكن أيضا تصوير العينات المحضرة باستخدام هذا البروتوكول باستخدام STORM الذي يسمح بالدقة الدقيقة للنصوص في الخلية.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الأنظمة لاستكشاف إحصائيات أحداث النسخ في الخلايا الفردية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تصف هذه المخطوطة طريقة لتسمية نصوص الحمض النووي الريبي الرسول الفردية (mRNA) باستخدام مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورة لاستخدامها في تجارب التهجين الموضعي الفلوري أحادي الجزيء (smFISH) في الإشريكية القولونية. تتيح هذه التقنية الكشف المتزامن عن نصوص الحمض النووي الريبي الرسول الفردية وتموقعها وتحديدها الكمي في خلايا فردية ثابتة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الأنظمة
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- التهجين الموضعي الفلوري أحادي الجزيء (smFISH) هي طريقة تصور قوية.
- تتيح هذه الطريقة دراسة العمليات النسخية على مستوى الخلية الفردية.
- فهم توطين وتحديد كمي نصوص الحمض النووي الريبي الرسول أمر حاسم لبيولوجيا الأنظمة.
- تعمل الإشريكية القولونية ككائن نموذجي لهذه التجارب.
هدف الدراسة
- لتسمية نصوص الحمض النووي الريبي الرسول الفردية في الإشريكية القولونية.
- لتصور توطين نصوص الحمض النووي الريبي الرسول باستخدام مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورة.
- لتعزيز فهم التباين النسخ بين الخلايا.
الطرق المستخدمة
- زراعة الإشريكية القولونية MG1655 في وسط LB بين عشية وضحاها.
- تخفيف المزرعة الليلية في وسط جديد.
- قياس الكثافة الضوئية لضمان ظروف النمو الصحيحة.
- تطبيق مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورة لتحليل smFISH.
النتائج الرئيسية
- تسمية ناجحة للنصوص الفردية للحمض النووي الريبي الرسول.
- تصور توطين نصوص الحمض النووي الريبي الرسول داخل الخلايا الثابتة.
- تحديد كمي للعمليات النسخية على مستوى الجزيء الواحد.
- رؤى حول التباين بين الخلايا في التعبير عن النصوص.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة نهجًا قويًا لدراسة ديناميكيات الحمض النووي الريبي الرسول.
- تسهم بمعلومات قيّمة في مجال بيولوجيا الأنظمة.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على أسئلة بحثية مختلفة تتعلق بالتعبير الجيني.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
