خلية واحدة القياس الكمي لمعدلات تحلل البروتين بالأسفار الوقت الفاصل بين الفحص المجهري في ثقافة الخلية ملتصقة

الهدف العام من نهج التصوير الفلوري هذا هو تحديد عمر النصف للبروتين ذي الأهمية في الخلايا الحية المفردة باستخدام علامة SNAP. يتم قلب البروتينات الخلوية على نطاق واسع مع معدلات التخليق والتدهور المحددة لكل بروتين ، وتخضع للتنظيم الفسيولوجي. ومع ذلك ، فإن الطرق الأكثر استخداما لتحديد عمر النصف للبروتين تقتصر إما على متوسطات السكان من خلايا القمل ، أو تتطلب استخدام مثبطات تخليق البروتين.

في هذا الفيديو ، نوضح كيف يمكن استخدام علامة SNAP بالاشتراك مع المجهر بفاصل زمني مضان لقياس عمر النصف للبروتين في الخلايا الحية. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنها تحقق دقة خلية واحدة ، وبالتالي توفر تقديرا لعدم تجانس نصف العمر في مجموعة من الخلايا المستزرعة. يمكن تطبيق الإجراء التجريبي المقدم هنا على أي نوع من الخلايا المزروعة الملتصقة ، مما يعبر عن بروتين ذي أهمية مدمج في علامة SNAP.

يمكن تحقيق ذلك إما عن طريق وضع علامات على البروتين الداخلي أو باستخدام الإفراط في التعبير عن البروتينات الموسومة. علامة SNAP هي نسخة متحولة من إنزيم إصلاح الحمض النووي ، O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase الذي يتفاعل على وجه التحديد مع البنزيل جوانين ، والذي يمكن أن يقترن بالمجسات الجزيئية. لذلك ، يمكن تصنيف أي بروتين اندماج SNAP-tag بشكل لا رجعة فيه بصبغة نفاذية لخلية الإزهار.

عند غسل الصبغة المتبقية ، سوف يتحلل عدد البروتين المسمى بشكل كبير ، ويمكن استنتاج عمر النصف للبروتين المقابل. في هذا الفيديو نستخدم الخلايا الجذعية الجنينية ، والتي تشكل مستعمرات ضيقة عندما تنمو بشكل كلاسيكي على أطباق مغلفة بالجيلاتين. للسماح لهم بالنمو كطبقة أحادية من الخلايا ، وبالتالي تحقيق دقة خلية واحدة لتجارب تصوير الإزهار ، قمنا بزراعتها على ألواح مغلفة ملتصقة بما في ذلك ، مما يقلل من تفاعلات الخلية إلى الخلية بوساطة الالتصاق الخلوية Inc المعبر عنها في غشاء البلازما.

قم بتخفيف inc المؤتلف الملتصق بخمسة نانوغرام لكل ميكرولتر في PBS ، وأضف 30 ميكرولترا من inc المخفف الملتصق بكل صمام في لوحة صمام 96 ، ومناسبة للتصوير. تجنب استخدام الماصة على نطاق واسع، لأن التصاق الماصة المؤتلفة هش للغاية. احتضان عند 37 درجة لمدة ساعة ونصف.

قم بشفط محلول التصاق inc ، واغسله مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر من PBS ، وأضف ما يصل إلى 200 ميكرولتر من وسط ثقافة ESL الملقب مسبقا. استخدم خطوط ESL التي تعبر عن بروتين ذي أهمية مدمج في علامة SNAP. اغسل الخلايا بخمسة مل من PBS.

ثم أضيفي ملتين من Tripson ، واحتضنيها لمدة أربع دقائق عند 37 درجة. أضف أربعة مل من وسط ثقافة ESL ، وأعد تعليقه ، ثم قم بتدويره عند 1000 طن لمدة أربع دقائق. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليقها في وسط جديد ، وعد الخلايا.

مقعد 30 ، 000 خلية لكل سنتيمتر مربع في لوحة التصوير المطلية الملتصقة بما يلي. استمر في تلطيخ صبغة SNAP بعد 24 ساعة من جلوس الخلية. قم بتخفيف صبغة الخلية في وسط زراعة ELS إلى التركيز الأمثل المحدد مسبقا.

قم بشفط الوسط باستخدام ماصة وأضف بعناية 50 ميكرولترا من صبغة SNAP المخففة. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة. استنشق الصبغة واغسلها ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من PBS قبل الدودة.

أضف 200 ميكرولتر من وسط ثقافة ESL ، واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة. قم بتنفيذ خطوات الغسيل عن طريق الماصة اللطيفة، ولا تستخدم شفاط أوتوماتيكي لأن الخلايا تميل إلى الانفصال بسهولة. كرر نفس خطوات الغسيل مرتين أخريين ، ثم أضف 200 ميكرولتر من وسيط التصوير.

استخدم الوسط الخالي من الفينول الأحمر لتقليل خلفية الإزهار. استخدم مجهرا يسمح بالتحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة ، وثاني أكسيد الكربون على خمسة بالمائة قبل الاستخدام ، واتركه يتوازن لمدة ساعة إلى ساعتين.

ضع اللوحة في المجهر ، وحدد بقعة مناسبة للتصوير. تظهر صور الحقل الساطع ESL المرفقة بطبق مطلي ملتصق في طبقة أحادية. حدد الهدف ، هدف 20X مناسب لهذا الحجم من ESLs.

حدد إعدادات الإضاءة لقناة الإزهار المراد تسجيلها. اضبط قوة الليزر والتعرض للحصول على إشارة قوية ، لأنها ستنخفض على مدار الفيلم. حدد معلمات الاكتساب لتجربة الفاصل الزمني.

بالنسبة للبروتينات ذات عمر النصف المتوقع من ساعتين إلى عشرين ساعة ، اختر أوقات اكتساب من 12 إلى 24 ساعة مع فترات زمنية من 15 دقيقة. ابدأ تجربة التصوير. استخدم برنامج FIJI لمعالجة الفيلم وتحليله.

اجمع الصور المكتسبة كمكدس وقم بتشويهها. استخدم وظيفة طرح الخلفية FIJI لإزالة الخلفية من جميع الصور الموجودة في المكدس. حدد خلية محل اهتمام، وارسم منطقة اهتمام حولها باستخدام شريط أدوات FIJI، وأضف منطقة الاهتمام إلى مدير العائد على الاستثمار.

انتقل إلى الإطار التالي وكرر الإجراءات السابقة. اتبع الخلية محل الاهتمام طوال فترة الفيلم واحفظ عائد الاستثمار المحدد لكل خلية متعقبة. انقر فوق القياس للحصول على قيم لمتوسط الشدة ومساحة عائد الاستثمار.

لتقدير الخلفية المحلية ، أضف منطقة اهتمام قريبة من خلية الاهتمام لكل إطار زمني. في النهاية ، انقر فوق قياس للحصول على قيم لمتوسط شدة الخلفية. أولا ، احسب متوسط شدة الخلية بضرب القيمة التي تم الحصول عليها لمتوسط شدة عائد الاستثمار الخلوي مع مساحتها.

بعد ذلك ، انتقل إلى حساب قيمة الخلفية المتكاملة للخلية ، عن طريق ضرب متوسط شدة عائد الاستثمار في الخلفية مع مساحة عائد الاستثمار الخلوي. أخيرا ، للحصول على قيمة مصححة في الخلفية للكثافة المتكاملة للخلية ، اطرح قيمة شدة الخلفية المتكاملة من قيمة شدة الخلية المتكاملة. للحصول على متوسط عمر نصف لمجموعة الخلايا ، قم بتطبيع القيم التي تم الحصول عليها إلى قيمة شدة الإطار الأول لكل خلية.

هذا يضمن أن كل خلية تساهم بنفس الوزن في متوسط قيمة نصف العمر بشكل مستقل عن شدة الإزهار المطلقة. بعد انقسامات الخلايا ، تتبع كلتا الخليتين الوليدتين بشكل منفصل وجمع شدتهما المتكاملة بعد طرح الخلفية لحساب تخفيف البروتين أثناء انقسام الخلية. احفظ مجموعات عائد الاستثمار لكلتا الخليتين الوليتين.

لتقدير عمر النصف للبروتين ، استخدم أداة تركيب المنحنى في MATLAB. يتبع اضمحلال البروتين أسيا حيث F (x) هي شدة الإزهار في النقطة الزمنية المحددة ، و "الشدة الأولية ، و b" معدل الاضمحلال. بعد الحصول على قيم معدل الاضمحلال ب "من الملاءمة ، يمكن حساب نصف العمر بقسمة لوغاريتم اثنين على ب "يظهر هذا الفيلم اضمحلال إزهار صبغة SNAP في خط خلايا اندماج دوكسيسيكلين غير قابل للاستخدام بأربعة SNAP-tag.

ستعتمد إشارة الإزهار المرصودة على خط الخلية المستخدم ، ومستوى التعبير عن البروتين المقابل محل الاهتمام ، بالإضافة إلى خصائص الصبغة المستخدمة. بالنسبة لتجارب تحلل البروتين ، من المهم استخدام تركيز صبغة SNAP مناسب. يجب أن يكون التركيز مرتفعا بما يكفي لإنتاج إشارة إزهار ساطعة في بداية الفاصل الزمني.

ومع ذلك ، فإن استخدام تركيزات عالية جدا من الصبغة قد يتسبب في ترك الصبغة المتبقية في الوسط ، حتى بعد الغسيل. قد ترتبط الصبغة الحرة لاحقا بجزيئات SNAP-tag المنتجة حديثا على مدار الفيلم ، مما قد يشوه منحنى الاضمحلال. لذلك من الأهمية بمكان تحسين تركيز صبغة SNAP عن طريق اختبار التخفيفات المختلفة.

يوضح هذا الشكل منحنيات الاضمحلال لثمانية تركيزات مختلفة من صبغة SNAP الإزهار التي تم اختبارها على خط خلية الدوكسيسيكلين غير الصالحة للاستخدام. تم اختيار تركيز صبغة أولي من ثلاثة ميكرومولار وفقا لتعليمات التصنيع لتصوير الخلايا الحية ، وتم إجراء تخفيف تسلسلي من واحد إلى ثلاثة حتى يصل إلى تركيز 1.4 نانو مولار. بالنسبة لأعلى تركيزين ، لا تنخفض الإشارة ، في حين أن الاضمحلال المرصود يتبع منحنى أسي للتركيزات المنخفضة.

في هذا المثال ، تم اختيار التركيز الأمثل ل 12 نانومولار ، لأن هذا التركيز يضمن كميات قليلة من الصبغة المتبقية المتبقية في الوسط بعد الغسيل ، لكن إشارة الإزهار لا تزال ساطعة بما يكفي لملاحظة منحنى اضمحلال واضح. يوفر البروتوكول الموصوف تقديرا للتباين من خلية إلى أخرى ونصف العمر لأي بروتين معين مدمج في علامة SNAP. يوضح هذا الشكل تحلل الخلية المفردة ، ومتوسط السكان لثلاثة خطوط مختلفة لخلايا اندماج SNAP-tag غير قابلة للاستخدام.

Nanog "و Oct4" قصيرة العمر إلى حد ما بمتوسط نصف عمر يبلغ 2.9 و 4.8 ساعة. في حين أن Srsf11 "أطول عمرا بمتوسط عمر نصف يبلغ 25.3 ساعة. تظهر المخططات الصندوقية توزيع نصف العمر للبروتينات الثلاثة.

لقد أظهرنا أن استخدام علامة SNAP ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري للفاصل الزمني الفلوري ، يسمح بتحديد عمر النصف لأي بروتين محل اهتمام. توفر قياسات اضمحلال الخلية المفردة تقديرا لعدم تجانس نصف الحياة في مجموعة من الخلايا ، والذي يتم حذفه عند استخدام طرق أخرى لتحديد نصف عمر البروتين. تتمثل إحدى أهم الخطوات عند استخدام علامة SNAP لمراقبة تسوس البروتين في التأكد من عدم ترك أي صبغة متبقية غير مرتبطة في وسط أو في الخلايا بعد الغسيل.

بخلاف ذلك ، قد يرتبط بجزيئات SNAP-tag المنتجة حديثا في وقت لاحق من سياق التجربة وبالتالي يضر بمنحنى الاضمحلال. يتم تحقيق ذلك من ناحية من خلال تنفيذ جميع خطوات الغسيل الموصوفة بعناية. من ناحية أخرى ، يجب أن يظل تركيز صبغة SNAP منخفضا قدر الإمكان بينما لا يزال في نطاق يسمح بالحصول على إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء.

يجب تحسين تركيز صبغة SNAP لكل تجربة وفقا لخط الخلية ونوع الصبغة المستخدمة. في حين أنه من الممكن أن تغير علامة SNAP عمر النصف للبروتينات المرشحة في بعض الحالات ، إلا أننا لا نرى أي دليل على مثل هذه التأثيرات ، حيث أن نصف العمر المحدد لاختبار البروتينات المرشحة يلتزم بالقيم المنشورة المتطابقة بشكل وثيق. لاستبعاد تأثير علامة SNAP على تدهور البروتين ، سيكون أحد الخيارات هو منع تخليق البروتين باستخدام cycloheximide ، وإجراء بقع في الحمام في نقاط زمنية مختلفة ، باستخدام جسم مضاد يتعرف على البروتين الأصلي.

ولمقارنة اضمحلال البروتين المرشح SNAP-tag مباشرة مع الإصدار الأصلي غير المميز.