كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

يتمثل الهدف العام لهذا البروتوكول في تحديد وإزالة نشاط النوكلييز الملوث أثناء تنقية البروتين. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الفيروسات القهقرية، مثل الكيمياء الحيوية وبنية وديناميكيات التكامل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتحديد وإزالة نشاط نوكلييز DNA الملوث من بروتين مؤتلف مستهدف أثناء عملية التنقية.

ابدأ بإذابة قرص واحد من بكتيريا E.coli التي تعبر عن إنزيم integrase للفيروس الرغوي النموذجي على الثلج. استخدم جهاز سونيكاتور (sonicator) مزوداً بقرن حيوي بقطر 0.5 بوصة مع طرف دقيق مستدق بقطر 0.125 بوصة، وقم بإجراء السونيكة لمدة 30 ثانية بسعة 30% مع وضع الأنبوب على الثلج. بعد السونيكة، انقل عينة الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد، وقم بتدويرها بسرعة 120,000 ×g لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.

بعد عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر كريّة واضحة، وقد يكتسب السائل الطافي لوناً أصفر. انقل السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 50-milliliter مبرد. بعد ذلك، قم بتجهيز عمود FPLC بطول 110-millimeter وقطر خمسة-millimeter، مع استخدام 1.5 milliliter من الراتنج المشحون بالنيكل.

أولاً، قم بتوصيل العمود بجهاز FPLC، ثم أضف المحلول المنظم. يجب أن يقوم الجهاز بجمع بيانات فورية للموصلية والامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. ويجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية.

إذا لزم الأمر، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر القراءات. وباستخدام حلقة فائقة (superloop)، قم بتحميل عينة البروتين على العمود بمعدل تدفق قدره 0.15 milliliters per minute مع حد أقصى للضغط يبلغ 0.5 megapascal. قم بتوصيل الحلقة الفائقة بجهاز AKTA FPLC.

بعد غسل العمود واستخلاص البروتينات، خذ أجزاءً حجم كل منها 15 µL من التدفق الأولي، ومن الغسيل، ومن أجزاء ذروة الامتصاص عند 280 nm، وأضف 15 µL من منظم عينات 2X SDS-PAGE إلى كل عينة. اغْلِ العينات لمدة ثلاث دقائق. ثم حمّل 10 µL من كل عينة على هلام 10% SDS-PAGE، جنباً إلى جنب مع أربعة µL من معايير البروتين المصبوغة مسبقاً.

افحص الهلام بصرياً لتحديد الكسور التي يبدو أنها تحتوي على إنزيم integrase الخاص بالفيروس الرغوي النموذجي بشكل نقي تقريباً. ادمج هذه الكسور، ودوّن الحجم أثناء عملية السحب بالماصة. وعادةً ما يكون هذا الحجم من 8 إلى 10 milliliters.

باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي، قم بقياس الامتصاصية فوق البنفسجية عند 280 نانومتر للكسور المجمعة، واحسب الكمية الإجمالية لبروتين إنتيغريز الفيروس الرغوي النموذجي. يبلغ المحصول النموذجي حوالي 10 مليجرام لكل لتر من المزرعة المستحثة. لإزالة وسم الهكساهيستيدين، قم بتكملة إنتيغريز الفيروس الرغوي النموذجي بتركيز نهائي قدره 10-millimolar من DTT و0.1-millimolar من EDTA.

بعد ذلك، أضف 15 µg من بروتياز human rhinovirus 3C لكل mg من إنترغيز prototype foamy virus، ثم حضن المزيج عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ولإجراء تجزئة لإنترغيز prototype foamy virus باستخدام كروماتوغرافيا الألفة بالهيبارين، قلل تركيز كلوريد الصوديوم في العينة إلى 200 mM عن طريق إضافة 1.5 حجم من المنظم C. ثم حمّل عينة إنترغيز prototype foamy virus المخففة على عمود heparin Sepharose بمعدل تدفق قدره 0.5 mL/min وبحد أقصى للضغط يبلغ 1 MPa. وبعد غسل العمود وجمع التدرج والغسلة النهائية، قم بتحليل العينة المحملة، والنضح، والغسيل، والأجزاء باستخدام تقنية 8%SDS-PAGE.

ثم قم بتقييم الكسور عن طريق صبغ الهلام بصبغة Coomassie blue. يمتلك إنزيم integrase الخاص بفيروس prototype foamy virus والنوكلييز الملوث ألفة مختلفة تجاه كروماتوغرافيا heparin Sepharose. حدد كسور heparin Sepharose التي يبدو أنها تحتوي على إنزيم prototype foamy virus integrase نقي تقريباً لاستخدامه في مقايسة النوكلييز.

لبدء مقايسة النوكلياز، اخلط 3 µL من جزء الهيبارين و50 ng من DNA بلازميد فائق الالتفاف بحجم 3 kb ومحلول منظم للتفاعل حتى يصل الحجم النهائي إلى 15 µL. قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 90 دقيقة. أوقف التفاعل باستخدام Proteinase K بتركيز 1 mg/mL و 0.5% SDS، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.

ثم أضف 3.5 µL من صبغة التحميل (loading dye) بتركيز 6X إلى تفاعلات مقايسة النوكلياز، وحمّل الحجم الكامل على هلام أغاروز بنسبة 1%. قم بتشغيل الهلام عند 100 فولت في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة أو حتى تصل جبهة الصبغة إلى نهاية الهلام. عند اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، يجب أن تظهر صورة الماسح الفلوري للهلام أن DNA الخطي يتحرك وفقاً لحجمه عند 3 kb، بينما يتحرك DNA ملتف للغاية (supercoiled) بشكل أسرع ليصل إلى حوالي 2 kb، وأن DNA الدائري المسترخي يتحرك بشكل أبطأ عند قرابة 3.5 kb.

باستخدام برنامج تحليل الصور، احسب حجم البكسل لكل من البلازميد فائق الالتفاف والخطي والدائري المسترخي في كل مسار. اعتبر مجموع أحجام البكسل لهذه الأشكال الثلاث من DNA قيمة DNA الكلية، واستخدمها لحساب النسبة المئوية للدوائر الخطية والمسترخية. تُظهر الأجزاء التي تحتوي على نوكلياز ملوث نسبة أعلى من الدوائر الخطية والمسترخية مقارنة بضابط السلب.

اجمع أجزاء الهيبارين سيفاروز (heparin Sepharose) التي لا تظهر نشاطًا ملوثًا للنوكلياز، وانقلها إلى أنابيب دياليز ذات حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 6 إلى 8 كيلودالتون وبقطر 10 مليمتر. أجرِ الدياليز عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل مقابل لتر واحد من محلول الدياليز. وفي اليوم التالي، استعد عينة إنترغريز الفيروس الرغوي النموذجية الخالية من النوكلياز من أنابيب الدياليز.

قِس الامتصاصية عند 280 نانومتر، واحسب التركيز النهائي للبروتين. ثم قسّم البروتين إلى حصص متساوية، وقم بتجميده سريعاً في النيتروجين السائل. بعد ذلك، خزن هذه الحصص عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

أُجري مقايسة النوكلياز كما هو موضح في هذا الفيديو. وتشمل الضوابط السلبية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) البلازميدي بدون بروتين، وعينة تنقية سابقة لإنزيم إنتيجريز الفيروس الرغوي النموذجي من النوع البري المعروف بخلوه من النوكلياز. أما الضابط الإيجابي لنشاط النوكلياز الملوث فهو عينة تنقية سابقة لإنزيم إنتيجريز الفيروس الرغوي النموذجي غير النشط تحفيزياً والمعروف باحتوائه على نوكلياز ملوث.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل المقايسات الكيميائية الحيوية أو تصوير الجزيء المنفرد، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل حركية الإنزيمات وديناميكيتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحديد وإزالة نشاط النيوكلياز الملوث من بروتين مؤتلف.