Name: كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: تعلم كشف وإزالة تلوث النوكليز أثناء تنقية إنزام فيروس مزبد النموذج المؤتلف باستخدام كروماتوغرافيا الهيبارين. يوفر هذا البروتوكول تحضير إنزام نقي خالٍ من النوكليز للدراسات الكيميائية الحيوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.

<ol><li>Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li>
<li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+reaction+pathway+and+critical+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li>
<li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li>
<li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

المؤتلف البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي، مثل إصلاح الحمض النووي البروتينات، الزبالين الأكسجين لتطبيقات الميكروسكوب جزيء واحد، أو إينتيجراسيس للفيروسات الرجعية، ينبغي أن تكون خالية من تلوث جرثومي نوكليسيس2،3. قد يسبب ارتباكا هذه الملوثات تفسير النتائج خلال فحوصات جزيء البيوكيميائية أو واحد الأكبر.
وقد وجدنا أن نوكلياسي بكتيرية وكثيراً ما شارك ينقي بتلبيتها، بفف ومع ذلك، يعرض في بفف تقارب سيفاروسي الهيبارين بسهولة يمكن تمييزها من ...

دراسات جزيء البيوكيميائية وواحد من تفاعلات البروتين مع الحمض النووي تتطلب البروتينات المؤتلف استثنائية نقية. تلوث نوكليسيس من البكتيريا يمكن أن تحجب نتائج هذه الاختبارات. تم العثور على نوكلاس تلويث في الأعمال التحضيرية للبروتينات المؤتلف الأكسجين الكاسح بروتوكاتيتشواتي-3 و 4-ديوكسيجيناسي (PCD) ونموذج مزبد الفيروس (فف) إينتيجراسي (في) المعزولة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)1 , 2 , 3.
فحوصات التكامل للفيروس تعتمد على تحويل الحمض النووي سوبيركويليد للمنتجات رصدت أو الخطي كتدبير في النشاط4. خلال العدوى الخلوية ينضم في طرفي كدنا الفيروسية الكروماتين المضيف5. ويطلق على كل نهاية الانضمام إلى رد فعل نقل حبلا. فحوصات المؤتلف في النشاط قد ينضم إلى اثنين الحمض النووي ليغومرات محاكاة كدنا الفيروسية وينتهي إلى هدف الحمض النووي في تكامل منسقة رد فعل4،5،6،،من78. وبدلاً من ذلك قد المؤتلف في الانضمام إلى واحدة فقط من نهاية الحمض النووي في موقع نصف ذات صلة غير فسيولوجيا تكامل رد فعل9،10. عندما سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي هو الهدف من التكامل، التكامل متضافرة منتجات خطيا الحمض النووي ومنتجات التكامل الموقع نصف الدوائر استرخاء. يتم تعريف هذه المنتجات رد فعل بقدرتهم النسبية على الحركة أثناء [اغروس] هلام التفريد1. إذا كان في المؤتلف تلويث نوكلاس، سيكون هناك دوائر استرخاء زائفة أو بلازميد ربما تطبق الخلط بين النتائج التجريبية. قد يكون المسمى ليغومرات الحمض النووي الفيروسي فلوريسسينتلي شكل قاطع تحديد المنتجات التكامل، بدلاً من المنتجات نوكلاس. ومع ذلك، في تفضل كثيرا سوبيركويليد الحمض النووي الأهداف؛ ويمكن أن تحرف أي خسارة في بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو الحمض النووي الخطي بتلويث نوكلاس النتائج وتفسير البيانات11. وبالتالي من الضروري إزالة nucleases البكتيرية من الفيروسات التراجعية في الأعمال التحضيرية.
في فف لها صلة مختلفة عن الهيبارين سيفاروسي مقارنة بال نوكلاس البكتيرية1. قد تكون مفصولة في فف ونوكلاس شطف تدرج خطي من الهيبارين سيفاروسي. عدم الكشف عن نوكلاس سهولة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 280 نانومتر ذروة أو الصوديوم التحليلية دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بدلاً من ذلك، يتم الكشف عن نوكلاس بمقايسة نشاط نوكلاس استخدام تحويل بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو المنتجات الخطية. يتم اختبار كل جزء بعد الهيبارين سيفاروسي اللوني لنشاط نوكلاس. في فف والملوث نوكلاس قد لا فرق في تقارب عن راتنج شاردة مونو-Q. هناك فرق صغيرة في تقارب عن الراتنج الموجبة مونو-S. ومع ذلك، لا يسمح القرار مونو-S نوكلاس البكتيرية وفي فف كفاءة فصل البروتينات. وفي نهاية المطاف، الهيبارين سيفاروسي انجذاب تطهير يقدم أفضل فصل نوكلاس البكتيرية من فف في وفي الاستفادة من حجم التحميل غير محدود.
اختبار لتلويث نوكلاس النشاط يمكن تكييفه مع غيرها من البروتينات. بروتين الفائدة من المحتمل أن يكون الخصائص تقارب البديلة مما في فف؛ ويجب تحديد الفرق في ربط خصائص البروتين الفائدة والملوث نوكلاس تجريبيا. قد تكون هذه المنهجية لتحديد التلوث nuclease تتكيف مع الراتنجات الأخرى بما في ذلك الموجبة مونو-S أو راتنجات تبادل شاردة مونو-Q. راتنجات التبادل الأيوني وتقارب قد توفر طريقة موثوقة لعزل بروتين المؤتلف من الفائدة من تلويث nucleases مع أي قيود على حجم البروتين خلال الفصل اللوني.

<table><tbody><tr><td>BL21 / DE3 رشيد E. قولونية</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>مرق رطل</td><td>EMD العلوم البيولوجية</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>أمبيسلين</td><td>أمريسكو</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>كلورامفينيكول &nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>أمريسكو</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>إيميدازول&nbsp;</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT & nbsp ؛</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen / Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>دينفيل Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>بروميد الإيثيديوم</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>الجلسرين</td><td>فيشر العلمي</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>الهيبارين Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C البروتياز&nbsp;</td><td>EMD للكيماويات</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

كشف وإزالة التلوث nuclease أثناء تنقية integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

بروتين إينتيجراسي (في) لفي النموذج الفيروس مزبد (فف) إنزيم نموذج لدراسة إليه التكامل للفيروسات الرجعية. مقارنة من الفيروسات القهقرية الأخرى، في فف القابلة للذوبان أكثر وأكثر قابلية للمعالجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه حساس لمثبطات في ذات الصلة سريرياً فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يدل على أن الآلية الحفازة في فف مماثلة إلى أن من "تلبيتها،" فيروس نقص المناعة البشرية-1 يحفز التساهمية ضم الحمض النووي التكميلية الفيروسية (كدنا) للهدف ودعا الحمض النووي في عملية نقل حبلا. ويدخل هذا رد فعل نقل حبلا نيكس إلى الهدف الحمض النووي. يمكن مرتبك تحليل إدماج نواتج التفاعل بوجود نوكليسيس أن المثل نك الحمض النووي. لقد ثبت نوكلاس جرثومي لتنقية يشترك مع المؤتلف في فف المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية (كولاي). هنا يصف لنا طريقة لعزل في فف من نوكلاس تلويث من الهيبارين التقارب اللوني. ويجري فرز الكسور بسهولة للتلوث نوكلياسي مع بلازميد سوبيركويليد و [اغروس] هلام التفريد. في بفف و nuclease تلويث عرض الانتماءات البديلة سيفاروسي الهيبارين مما يسمح إعداد خالية nuclease المؤتلف بفف في مناسبة لتحليل جزيء البيوكيميائية أو واحد الجزء الأكبر من التكامل.

المؤتلف فف في كثير من الأحيان ملوثة نوكلاس بكتيرية1. فحوصات التكامل البيوكيميائية تعتمد على كوانتيتيشن لتحويل سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي للدوائر استرخاء ومنتجات الخطي. يمكن أن يؤدي وجود نوكلاس تلويث إلى كوانتيتيشن زائفة لهذه الاختبارات. التعبير في فف مع علامة هيكساهيستيديني التي يسببها في كولاي (الشكل 1) وتنقيتها أولاً بالنيكل التقارب اللوني (الشكل 2). يتم تجميع الكسور مع نقية تقريبا فف في وهو المشقوق العلامة هيكساهيستيديني...

هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

يتمثل الهدف العام لهذا البروتوكول في تحديد وإزالة نشاط النوكلييز الملوث أثناء تنقية البروتين. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الفيروسات القهقرية، مثل الكيمياء الحيوية وبنية وديناميكيات التكامل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بتحديد وإزالة نشاط نوكلييز DNA الملوث من بروتين مؤتلف مستهدف أثناء عملية التنقية.ابدأ بإذابة قرص واحد من بكتيريا E.coli التي تعبر عن إنزيم integrase للفيروس الرغوي النموذجي على الثلج. استخدم جهاز سونيكاتور (sonicator) مزوداً بقرن حيوي بقطر 0.5 بوصة مع طرف دقيق مستدق بقطر 0.125 بوصة، وقم بإجراء السونيكة لمدة 30 ثانية بسعة 30% مع وضع الأنبوب على الثلج. بعد السونيكة، انقل عينة الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي فائق التبريد، وقم بتدويرها بسرعة 120,000 ×g لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.بعد عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر كريّة واضحة، وقد يكتسب السائل الطافي لوناً أصفر. انقل السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 50-milliliter مبرد. بعد ذلك، قم بتجهيز عمود FPLC بطول 110-millimeter وقطر خمسة-millimeter، مع استخدام 1.5 milliliter من الراتنج المشحون بالنيكل.أولاً، قم بتوصيل العمود بجهاز FPLC، ثم أضف المحلول المنظم. يجب أن يقوم الجهاز بجمع بيانات فورية للموصلية والامتصاصية للأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. ويجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية.إذا لزم الأمر، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر القراءات. وباستخدام حلقة فائقة (superloop)، قم بتحميل عينة البروتين على العمود بمعدل تدفق قدره 0.15 milliliters per minute مع حد أقصى للضغط يبلغ 0.5 megapascal. قم بتوصيل الحلقة الفائقة بجهاز AKTA FPLC.بعد غسل العمود واستخلاص البروتينات، خذ أجزاءً حجم كل منها 15 µL من التدفق الأولي، ومن الغسيل، ومن أجزاء ذروة الامتصاص عند 280 nm، وأضف 15 µL من منظم عينات 2X SDS-PAGE إلى كل عينة. اغْلِ العينات لمدة ثلاث دقائق. ثم حمّل 10 µL من كل عينة على هلام 10% SDS-PAGE، جنباً إلى جنب مع أربعة µL من معايير البروتين المصبوغة مسبقاً.افحص الهلام بصرياً لتحديد الكسور التي يبدو أنها تحتوي على إنزيم integrase الخاص بالفيروس الرغوي النموذجي بشكل نقي تقريباً. ادمج هذه الكسور، ودوّن الحجم أثناء عملية السحب بالماصة. وعادةً ما يكون هذا الحجم من 8 إلى 10 milliliters.باستخدام جهاز قياس الطيف الضوئي، قم بقياس الامتصاصية فوق البنفسجية عند 280 نانومتر للكسور المجمعة، واحسب الكمية الإجمالية لبروتين إنتيغريز الفيروس الرغوي النموذجي. يبلغ المحصول النموذجي حوالي 10 مليجرام لكل لتر من المزرعة المستحثة. لإزالة وسم الهكساهيستيدين، قم بتكملة إنتيغريز الفيروس الرغوي النموذجي بتركيز نهائي قدره 10-millimolar من DTT و0.1-millimolar من EDTA.بعد ذلك، أضف 15 µg من بروتياز human rhinovirus 3C لكل mg من إنترغيز prototype foamy virus، ثم حضن المزيج عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ولإجراء تجزئة لإنترغيز prototype foamy virus باستخدام كروماتوغرافيا الألفة بالهيبارين، قلل تركيز كلوريد الصوديوم في العينة إلى 200 mM عن طريق إضافة 1.5 حجم من المنظم C. ثم حمّل عينة إنترغيز prototype foamy virus المخففة على عمود heparin Sepharose بمعدل تدفق قدره 0.5 mL/min وبحد أقصى للضغط يبلغ 1 MPa. وبعد غسل العمود وجمع التدرج والغسلة النهائية، قم بتحليل العينة المحملة، والنضح، والغسيل، والأجزاء باستخدام تقنية 8%SDS-PAGE.ثم قم بتقييم الكسور عن طريق صبغ الهلام بصبغة Coomassie blue. يمتلك إنزيم integrase الخاص بفيروس prototype foamy virus والنوكلييز الملوث ألفة مختلفة تجاه كروماتوغرافيا heparin Sepharose. حدد كسور heparin Sepharose التي يبدو أنها تحتوي على إنزيم prototype foamy virus integrase نقي تقريباً لاستخدامه في مقايسة النوكلييز.لبدء مقايسة النوكلياز، اخلط 3 µL من جزء الهيبارين و50 ng من DNA بلازميد فائق الالتفاف بحجم 3 kb ومحلول منظم للتفاعل حتى يصل الحجم النهائي إلى 15 µL. قم بالتحضين عند 37 °C لمدة 90 دقيقة. أوقف التفاعل باستخدام Proteinase K بتركيز 1 mg/mL و 0.5% SDS، ثم قم بالتحضين عند 37 °C لمدة ساعة واحدة.ثم أضف 3.5 µL من صبغة التحميل (loading dye) بتركيز 6X إلى تفاعلات مقايسة النوكلياز، وحمّل الحجم الكامل على هلام أغاروز بنسبة 1%. قم بتشغيل الهلام عند 100 فولت في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة أو حتى تصل جبهة الصبغة إلى نهاية الهلام. عند اكتمال عملية الرحلان الكهربائي، يجب أن تظهر صورة الماسح الفلوري للهلام أن DNA الخطي يتحرك وفقاً لحجمه عند 3 kb، بينما يتحرك DNA ملتف للغاية (supercoiled) بشكل أسرع ليصل إلى حوالي 2 kb، وأن DNA الدائري المسترخي يتحرك بشكل أبطأ عند قرابة 3.5 kb.باستخدام برنامج تحليل الصور، احسب حجم البكسل لكل من البلازميد فائق الالتفاف والخطي والدائري المسترخي في كل مسار. اعتبر مجموع أحجام البكسل لهذه الأشكال الثلاث من DNA قيمة DNA الكلية، واستخدمها لحساب النسبة المئوية للدوائر الخطية والمسترخية. تُظهر الأجزاء التي تحتوي على نوكلياز ملوث نسبة أعلى من الدوائر الخطية والمسترخية مقارنة بضابط السلب.اجمع أجزاء الهيبارين سيفاروز (heparin Sepharose) التي لا تظهر نشاطًا ملوثًا للنوكلياز، وانقلها إلى أنابيب دياليز ذات حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 6 إلى 8 كيلودالتون وبقطر 10 مليمتر. أجرِ الدياليز عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل مقابل لتر واحد من محلول الدياليز. وفي اليوم التالي، استعد عينة إنترغريز الفيروس الرغوي النموذجية الخالية من النوكلياز من أنابيب الدياليز.قِس الامتصاصية عند 280 نانومتر، واحسب التركيز النهائي للبروتين. ثم قسّم البروتين إلى حصص متساوية، وقم بتجميده سريعاً في النيتروجين السائل. بعد ذلك، خزن هذه الحصص عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.أُجري مقايسة النوكلياز كما هو موضح في هذا الفيديو. وتشمل الضوابط السلبية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) البلازميدي بدون بروتين، وعينة تنقية سابقة لإنزيم إنتيجريز الفيروس الرغوي النموذجي من النوع البري المعروف بخلوه من النوكلياز. أما الضابط الإيجابي لنشاط النوكلياز الملوث فهو عينة تنقية سابقة لإنزيم إنتيجريز الفيروس الرغوي النموذجي غير النشط تحفيزياً والمعروف باحتوائه على نوكلياز ملوث.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل المقايسات الكيميائية الحيوية أو تصوير الجزيء المنفرد، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل حركية الإنزيمات وديناميكيتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحديد وإزالة نشاط النيوكلياز الملوث من بروتين مؤتلف.

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

جينوم فيروس الأنفلونزا يتكون من ثمانية مجمعات منفصلة من الحمض النووي الريبي والبروتينات ، ووصف المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNPs). وتصف هذه الورقة تنقية التدرج الجلسرين والتصور انتقال المجهر الإلكتروني من vRNPs الأنفلونزا.

تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

هيكل القائم على تصميم الأدوية تلعب دورا هاما في تطوير العقاقير. متابعة أهداف متعددة في نفس الوقت يزيد كثيرا من فرص النجاح لاكتشاف الرصاص. يسلط الضوء على المقالة التالية كيفية مركز سياتل الجينوم الإنشائية للأمراض المعدية يستخدم نهجا متعدد الاهداف لتحديد الجينات إلى هيكل إنفلونزا PB2 A الوحيدات.

متعدد الاهداف نهج المعالجة المتوازية لتحديد الجينات إلى هيكل البلمرة الأنفلونزا PB2 الوحدة الفرعية

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Fluorescence-Based Detection and Purification of Recombinant Vaccinia Virus

نصف بروتوكولا لتضخيم مواقع تكامل الفيروسات القهقرية من الحمض النووي الجيني للخلايا المصابة ، وتسلسل تقاطعات الفيروس المضيف المضخمة ، ثم تعيين هذه التسلسلات إلى جينوم مرجعي. نصف أيضا تقنيات لتحديد توزيع مواقع التكامل بالنسبة للتعليقات التوضيحية الجينومية المختلفة باستخدام BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

تصف هذه المخطوطة الإجراء التجريبي وتحليل البرمجيات لمقايسة موقع التكامل ثنائية الاتجاه التي يمكن أن تحلل في وقت واحد المنبع والمصب ناقلات الحمض النووي تقاطع المضيف. يمكن استخدام منتجات ير ثنائية الاتجاه لأي منصة تسلسل المصب. البيانات الناتجة هي مفيدة لمقارنة عالية الإنتاجية، الكمية من أهداف الحمض النووي متكاملة.

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

Integrase الفيروسات التراجعية المؤتلف والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أن تشكل مجمع نشطة انزيماتيكالي المعروف باسم إينتاسومي. ويمكن استخدام إينتاسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية، والحركية. هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تجميع وتنقية إينتاسوميس فيروس مزبد النموذج.

الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد

يصف لنا هنا الجيل في المختبر للحمض النووي HBV عبر نظام عدوى بفيروس التهاب الكبد البائي والكشف عن درجة عالية من الحساسية للتكامل (1 – 2 نسخة) استخدام معكوس متداخلة PCR.

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتوليد وتنقية النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي باستخدام طريقة كروماتوغرافيا تقارب محسنة قائمة على الهيبارين. إنه يقدم نهجا بسيطا وقابلا للتطوير وفعالا من حيث التكلفة ، مما يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي الفائق. تظهر النواقل الناتجة درجة نقاء عالية ونشاطا بيولوجيا ، مما يثبت قيمتها في الدراسات قبل السريرية.

عزل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي من خلال بروتوكول كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين أحادي الخطوة وشبه آلي

الطفرات الإدراجية هي أداة أساسية في علم الوراثة الأمامية لتحديد العناصر الجينومية الوظيفية. هنا ، نصف الشاشة المستندة إلى الإدراج للعناصر الوظيفية والنصوص (InSET) ، وهي طريقة للكشف عن مواقع تكامل الفيروسات داخل مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية القائمة على فيروس العدس.

تحديد مواقع تكامل الفيروسات العدسية ذات الصلة وظيفيا في مكتبة خلايا الطفرات الإدخالية

يصف هذا البروتوكول الاختبار الكيميائي الحيوي لتحول الهلام لقياس نشاط FEN1 (Flap Endonuclease 1) وتطور المثبطات.

الكشف القائم على التألق لنشاط نوكلياز FEN1 وفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

تعلم كشف وإزالة تلوث النوكليز أثناء تنقية إنزام فيروس مزبد النموذج المؤتلف باستخدام كروماتوغرافيا الهيبارين. يوفر هذا البروتوكول تحضير إنزام نقي خالٍ من النوكليز للدراسات الكيميائية الحيوية.

كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

استكشف المزيد من الفيديوهات