كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد وإزالة نشاط النوكلياز الملوث أثناء تنقية البروتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الفيروسات القهقرية ، مثل الكيمياء الحيوية والبنية وديناميكيات التكامل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد وإزالة نشاط نوكلياز الحمض النووي الملوث من بروتين مؤتلف محل اهتمام أثناء التنقية.

ابدأ بإذابة حبيبات واحدة من الإشريكية القولونية التي تعبر عن نموذج أولي للفيروس الرغوي على الجليد. استخدم مكبر صوتي مجهز بقرن حيوي بقطر 0.5 بوصة مع طرف صغير مدبب بقطر 0.125 بوصة للصوتنة لمدة 30 ثانية بسعة 30٪ مع الأنبوب على الجليد. بعد صوتنة ، انقل عينة الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بارد ، وتدور عند 120 ، 000 مرة جم لمدة 60 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي ، يجب أن يكون هناك حبيبات واضحة ، وقد يكون للطافي لون أصفر. انقل المادة الطافية إلى أنبوب مخروطي بارد سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بإعداد عمود FPLC بطول 110 ملم وقطره خمسة ملليمترات مع راتنج مشحون بالنيكل سعة 1.5 مل.

أولا ، قم بتوصيل العمود بأداة FPLC ، وقم بتطبيق المخزن المؤقت. يجب أن تقوم الأداة بجمع بيانات في الوقت الفعلي عن الموصلية وامتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. يجب أن تستقر قراءات الموصلية والأشعة فوق البنفسجية.

إذا لزم الأمر، استمر في تدفق المخازن المؤقتة عبر العمود حتى تصبح القراءات مستقرة. باستخدام حلقة فائقة ، قم بتحميل عينة البروتين على العمود بمعدل تدفق 0.15 مل في الدقيقة بحد أقصى للضغط يبلغ 0.5 ميجا باسكال. قم بإرفاق الحلقة الفائقة ب AKTA FPLC.

بعد غسل العمود وتجنب البروتينات ، اختر حصصا سعة 15 ميكرولترا من كسور التدفق الأولي والغسيل والامتصاص الذروة 280 نانومتر ، وأضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعينة 2X SDS-PAGE إلى كل عينة. اغلي العينات لمدة ثلاث دقائق. قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة على 10٪ من المواد الهلامية SDS-PAGE ، جنبا إلى جنب مع أربعة ميكرولترات من معايير البروتين الملطخة مسبقا.

افحص الجل بصريا لتحديد الكسور التي يبدو أنها تحتوي على نموذج أولي نقي تقريبا للفيروس الرغوي. اجمع بين هذه الكسور ، وقم بتدوين الحجم أثناء سحب العينات. هذا عادة ما يكون من ثمانية إلى 10 ملليلتر.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر من الكسور المجمعة ، واحسب الكمية الإجمالية لبروتين إنتگراز الفيروس الرغوي النموذجي. يبلغ العائد النموذجي حوالي 10 ملليغرام لكل لتر من الثقافة المستحثة. لإزالة علامة hexahistidine ، استكمل النموذج الأولي للفيروس الرغوي بتركيز نهائي من DTT 10 ملليمولار و 0.1 مللي مولار EDTA.

ثم أضف 15 ميكروغراما من بروتياز فيروس الأنف البشري 3C لكل ملليغرام من النموذج الأولي للفيروسات الرغوية ، واحتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لإجراء تجزئة كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين للنموذج الأولي للفيروس الرغوي ، قلل تركيز كلوريد الصوديوم للعينة إلى 200 ملليمولار عن طريق إضافة 1.5 حجم من المخزن المؤقت C. ثم قم بتحميل عينة النموذج الأولي المخفف للفيروس الرغوي إلى عمود الهيبارين Sepharose بمعدل تدفق 0.5 مل في الدقيقة مع حد أقصى للضغط يبلغ ميجا باسكال واحد. بعد غسل العمود وجمع التدرج والغسيل النهائي ، قم بتحليل الحمل والتدفق والغسيل والكسور بنسبة 8٪ SDS-PAGE.

ثم قم بتقييم الكسور عن طريق تلطيخ الجل باللون الأزرق Coomassie. النموذج الأولي للفيروس الرغوي والنوكلياز الملوث لهما صلات مختلفة مع كروماتوغرافيا الهيبارين السيفاروز. تحديد كسور الهيبارين السيفاروسي التي يبدو أنها تحتوي على نموذج أولي تقريبا من إنتجراز الفيروس الرغوي لاستخدامه في مقايسة النوكلياز.

لبدء مقايسة النوكلياز ، اجمع بين ثلاثة ميكرولترات من جزء الهيبارين و 50 نانوغراما من الحمض النووي البلازميد فائق الالتفاف بثلاثة كيلو قاعدة ومخزن تفاعلي إلى حجم نهائي يبلغ 15 ميكرولترا. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. أوقف التفاعل بملليغرام واحد لكل مليلتر من البروتيناز K و 0.5٪ SDS ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

ثم أضف 3.5 ميكرولتر من صبغة التحميل 6X إلى تفاعلات فحص النوكلياز ، وقم بتحميل الحجم بالكامل على هلام الاغاروز 1٪. قم بتشغيل الجل على حرارة 100 فولت في درجة الحرارة المحيطة لمدة ساعة واحدة أو حتى تصل مقدمة الصبغة إلى نهاية الجل. عند اكتمال الرحلان الكهربائي ، يجب أن تظهر صورة الماسح الضوئي الفلوري للهلام أن الحمض النووي الخطي يعمل بشكل صحيح عند ثلاثة كيلو بايت ، ويعمل الحمض النووي فائق الالتفاف بشكل أسرع إلى حوالي كيلو بايت ، وأن الحمض النووي الدائري المريح يعمل بشكل أبطأ عند ما يقرب من 3.5 كيلو بايت.

باستخدام برنامج تحليل الصور ، احسب حجم البكسل لبلازميد الدائرة فائقة الالتفاف والخطية والمريحة في كل حارة. استدعي مجموع أحجام البكسل لهذه الأشكال الثلاثة للحمض النووي القيمة الإجمالية للحمض النووي ، واستخدمه لحساب النسبة المئوية للدوائر الخطية والمريحة. تظهر الكسور التي تحتوي على نوكلياز ملوث نسبة أعلى من الدوائر الخطية والمريحة مقارنة بالتحكم السلبي.

اجمع بين كسور الهيبارين السيفاروزيون التي لا تظهر نشاط نوكلياز ملوث ، وانقلها إلى 10 ملم ، ستة إلى ثمانية كيلودالتون ، أنبوب غسيل الكلى المقطوع للوزن الجزيئي. غسيل الكلى عند أربع درجات مئوية طوال الليل مقابل لتر واحد من محلول غسيل الكلى. في اليوم التالي ، استرجع عينة النموذج الأولي للفيروس الرغوي الخالي من النوكلياز من أنبوب غسيل الكلى.

قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر ، واحسب تركيز البروتين النهائي. اقتبس البروتين ، وقم بالتجميد في النيتروجين السائل. ثم قم بتخزين الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

تم إجراء فحص النوكلياز كما هو موضح في هذا الفيديو. تشمل الضوابط السلبية الحمض النووي البلازميد بدون بروتين وتنقية سابقة للنموذج الأولي للفيروس الرغوي من النوع البري المعروف بأنه خال من النوكلياز. التحكم الإيجابي في نشاط النوكلياز الملوث هو تنقية سابقة لنموذج أولي للفيروس الرغوي غير النشط تحفيزيا المعروف باحتوائه على نوكلياز ملوث.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل المقايسات الكيميائية الحيوية أو تصوير الجزيء الفردي ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل حركية الإنزيم وديناميكياته. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد وإزالة نشاط النوكلياز الملوث من البروتين المؤتلف.