تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن
ديسمبر 8, 2017
هنا، نحن نقدم بروتوكول لثقافة 3D من الفئران الخلايا إطلاق المستمدة من الدماغ، بما في ذلك أستروسيتيس، ميكروجليا، وأوليجوديندروسيتيس. نظهر ثقافة الخلية الأولية وحمض الهيالورونيك ميثاكريلاتيد (حماة) هيدروجيل التوليف وتغليف هامافوتو--البلمرة وخلية وعينه تجهيز للتصوير المجهري الإلكترون [كنفوكل] والمسح.
الهدف العام من بروتوكول زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد هذا هو نمذجة حدث الندبة الدبقية للجهاز العصبي المركزي باستخدام خلايا المؤشر الرئيسية: الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الالتهاب العصبي ، مثل إمكانية الخلايا الدبقية لتعزيز استراتيجيات التجدد وكشف الندبة الدبقية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تمييز البيولوجيا الدبقية بسرعة في بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد مع تلاعب منهجي وعالي الوضع. لتحضير زلات الغطاء للبذر ، ابدأ بإضافة مليلتر واحد من 3 بروبيل ميثاكريلات إلى 49 مل من الماء المقطر لعمل محلول 2٪. ثم ضع غطاء زجاجي مقاس 18 ملم في المحلول وصخور لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، اشطف زلات الغطاء عن طريق غمس كل زلة غطاء بشكل متسلسل في ثلاث أكواب سعة 100 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم جفف الغطاء ينزلق في فراغ باستخدام مجفف وفرن على حرارة 40 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم الملقط لغمر زلات الغطاء الفردية بسرعة في 70٪ من الإيثانول. ثم ، دون تجفيف ، قم بإسقاط كل زلة غطاء في بئر من طبق 12 بئرا. بعد ذلك ، اغسل كل بئر بمليلتر واحد من الماء المعقم منزوع الأيونات. ثم أضف ملليلتر واحد من بولي معقم
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً للاستزراع ثلاثي الأبعاد للخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الجرذ، بما في ذلك الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا الدبقية قليلة التغصن. وتفصل المقالة عمليات استزراع الخلايا الأولية، وتخليق الهيدروجيل، وتقنيات التصوير.
مكونات الدراسة الرئيسية
المجال العلمي
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- هندسة الأنسجة
خلفية علمية
- تعد أنظمة المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد أساسية لدراسة الخلايا الدبقية.
- تلعب الخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الجرذ دورًا محوريًا في علم الأحياء العصبي.
- توفر الهيدروجيلات بيئة داعمة لنمو الخلايا.
- تعتبر تقنيات التصوير حيوية لتحليل مورفولوجيا الخلايا.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول موثوق لاستزراع الخلايا الدبقية ثلاثية الأبعاد (3D).
- تعزيز فهم التفاعلات بين الخلايا الدبقية.
- تسهيل التصوير المتقدم للخلايا المستزرعة.
الطرق المستخدمة
- الاستنبات الخلوي الأولي للخلايا الدبقية المشتقة من دماغ الجرذ.
- تخليق هيدروجيل حمض الهيالورونيك الميثاكريلي (HAMA).
- البلمرة الضوئية لـ HAMA لتغليف الخلايا.
- معالجة العينات للفحص بالمجهر البؤري والمجهر الإلكتروني الماسح.
النتائج الرئيسية
- نجاح تغليف الخلايا الدبقية في هيدروجيل HAMA.
- إثبات حيوية ووظيفة الخلايا المستزرعة.
- تحقيق تصوير عالي الجودة لمورفولوجيا الخلايا.
- يوفر البروتوكول أساساً للدراسات المستقبلية على الخلايا الدبقية.
الاستنتاجات
- يُعد البروتوكول المطور فعالاً لزراعة الخلايا الدبقية ثلاثية الأبعاد.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في مختلف مجالات أبحاث العلوم العصبية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذا الإطار لإجراء تحقيقات متقدمة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يُتيح نمذجة العمليات الالتهابية العصبية في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجياً الحد من المخاطر الميكانيكية للعلاجات التي تستهدف الخلايا الدبقية. ويدعم هذا النهج الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال محاكاة تكوين الندبة الدبقية، وهي سمة مرضية رئيسية في إصابات الجهاز العصبي المركزي والتنكس العصبي. وتسهل هذه الطريقة الاستمرارية الانتقالية من مرحلة الاكتشاف إلى التقييم قبل السريري من خلال توفير نظام مرتبط بالمرض لفحص المركبات المعدلة للمناعة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء تفاعلات الخلايا الدبقية في بيئة مجهرية ثلاثية الأبعاد لتوضيح الآليات المرضية للالتهاب العصبي.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الخلايا الدبقية الصغيرة، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية قليلة التغصن كأهداف علاجية في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الأهداف العلاجية من خلال نمذجة تكوين الندبة الدبقية، والتي تعد محركاً رئيسياً للسمية الخلوية وضعف التجدد.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر منصة قياسية وقابلة للتكرار لتحضير الهيدروجيلات المحملة بالخلايا الدبقية لغرض فحص المركبات.
- القيمة التشغيلية: يتيح التقييم الكمي لاستجابات الخلايا الدبقية عبر التصوير المجهري البؤري (confocal) والمجهري الإلكتروني الماسح (SEM)، مما يدعم جاهزية الاختبار.
- القابلية للتوسع: يتوافق مع المعالجة عالية الإنتاجية وتعديل الركائز النشطة بيولوجياً لتحسين الاختبار.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والعمل قبل السريري من خلال نمذجة نظام ذي صلة بالمرض لتكوين الندبة الدبقية.
- تقليل المخاطر الآلية: يسمح بتقييم تأثيرات المركبات على التنشيط الدبقي ونضج الندبة، مما يوجه التقدم في البحث بناءً على المخاطر المعدلة.
- مواءمة المؤشرات الحيوية: يدعم تقييم المورفولوجيا الدبقية والتفاعلية كمؤشرات حيوية انتقالية للاستجابة الالتهابية العصبية.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم الدراسات قبل السريرية، وذلك من خلال توفير نظام زراعة دبقية ثلاثي الأبعاد ينمذج الاعتلالات المرضية للالتهاب العصبي.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات الالتهاب التي تتوسطها الخلايا الدبقية والتواصل الخلوي في بيئة محاكية حيويًا.
- الفحص: يتيح توحيد المقايسات والقراءات الكمية لتقييم التأثيرات المعدلة للمناعة على النمط الظاهري والوظيفة الدبقية.
- التحليلات: يوفر مخرجات تصوير عالية الدقة عبر المجهر البؤري والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لقياس مورفولوجيا الخلايا وتوزيعها وحالات تنشيطها.
- الأبحاث الانتقالية: يربط تعديل الأهداف الدبقية المبكرة بالنتائج قبل السريرية من خلال محاكاة عملية مرضية رئيسية في إصابات وأمراض الجهاز العصبي المركزي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة هيدروجيل قابلة لإعادة الاستخدام لنماذج الالتهابات العصبية المزمنة والحادة عبر مشاريع الاكتشاف المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال الرؤية الميكانيكية لتكوين الندبة الدبقية وشلالات الالتهاب العصبي.
- القيمة التشغيلية: توحيد المعايير، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع للمزارع الدبقية ثلاثية الأبعاد لضمان اتساق التجارب بين الفرق المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل الغموض البيولوجي في تفاعل الأهداف الدبقية وتعديل المسارات.
- التأثير على المحفظة: تحديد الأولويات للعلاجات الخاصة بالجهاز العصبي المركزي بناءً على المخاطر المعدلة وفقاً للفعالية في تعديل الاستجابات الدبقية في نظام مرتبط بالمرض.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب هذه العملية خبرة في عزل الخلايا الدبقية الأولية، وتخليق الهيدروجيل، وتقنيات الزراعة ثلاثية الأبعاد.
- تتضمن الأجهزة المستخدمة أنظمة البلمرة الضوئية بالأشعة فوق البنفسجية (UV)، والمجاهر confocal، والمجاهر الإلكترونية الماسحة لأغراض التوصيف.
- يستلزم التوحيد القياسي بين الفرق استخدام تركيبة هيدروجيل متسقة، وكثافة استزراع خلوية موحدة، وبروتوكولات تصوير متطابقة.
- قد يتطلب التكيف مع مصادر دبقية أخرى أو نماذج مرضية مختلفة تحسين صلابة الهيدروجيل والطلاء النشط بيولوجياً.
- تشمل القيود العملية التباين في حصيلة الخلايا الأولية وضرورة اتباع التقنيات التعقيمية خلال خطوات التغليف والبلمرة.
