Name: مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: تعلم مجهر الفلورة المناعي لـ γH2AX و53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا السرطانية. هذه التقنية تُمكّن الباحثين من تصور أضرار الحمض النووي الفردية ودراسة آليات عدم الاستقرار الوراثي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد المشروع "الألماني خوسيه كاريراس اللوكيميا المؤسسة" (14 دجكلس R/2017).

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا من "الثاني لجنة الأخلاقيات" في "مانهايم كلية الطب" في جامعة هايدلبرغ. كتب تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأفراد-
 1. "إعداد مواد" <ol><li>حل الأسهم تخثر الدم: تعد حلاً أسهم التخثر 200 وحدة دولية الهيبارين كل مل في كلوريد الصوديوم 0.9%. ملء كل من أنابيب جمع (رسم حجم مل 9) مع 2 مل الحل الأسهم التخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.</li>
	<li>حل تحلل للخلايا الحمراء: تحضير 10 × حل تحلل للخلايا الحمراء مع ز 82.91 كلوريد الأمونيوم وبيكربونات الأمونيوم 7.91 ز 2 مل من 0.5 م الإيثيلين حل حمض pH 8.0 بتذويب الوكلاء في الماء المقطر مزدوجة لإجمالي حجم 1 ل.</li>
	<li>حل التثبيت: ميليلتر 8.3 إضافة حل هيدروكسيد البوتاسيوم 1 متر إلى 360 ملغ بارافورمالدهيد (PFA) في أنبوب ميكروتيتير. ملء الأنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للعلامة 1 مل من الأنبوب والحرارة الأنبوب في كتلة تدفئة في 95 درجة مئوية للحصول على 1 مل حل منهاج العمل 36%. نقل الحل منهاج العمل 36% 1 مل إلى أنبوب بسعة 15 مل. إضافة 8 مل برنامج تلفزيوني في حل منهاج العمل 36% 1 مل، للحصول على 9 مل حل الأسهم منهاج العمل 4%. قاسمة 4% PFA الحل المخزون والمخزن عند-18 درجة مئوية حتى تستخدم لتثبيت الخلايا. 
	تنبيه: 1) هيدروكسيد البوتاسيوم والحل التآكل. كن على علم من حماية العين والجلد. 2) منهاج عمل بيجين المسببة للسرطان. تجنب تماس الجلد والاستنشاق. إعداد الحل التثبيت تحت غطاء محرك السيارة-</li>
	<li>الحل بيرميبيليزيشن: إضافة 50 ميليلتر أوكتوكسينول 9 إلى 50 مل برنامج تلفزيوني الحصول على حل حوالي 0.1% 9 أوكتوكسينول-</li>
	<li>عرقلة الحل: إعداد 5% و % 2 عرقلة الحلول بخلط البروتين عامل حجب مع برنامج تلفزيوني ومخزن في 6 &#8211; 8 ° C.</li>
</ol> 2. إعداد العينات <ol><li>الليفية في ثقافة الخلية: زراعة الخلايا الليفية البشرية خط الخلية نهدف في هوميديفيد 5% CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 4 مم الجلوتامين، و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
	إزالة الليفية <ol><li>إعداد شريحة مجهر مع تمسكا <ol><li>المتوسطة من قارورة (منطقة النمو 2 75 سم) مع تزايد الليفية نهدف أضعافاً مضاعفة. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني قارورة. أغسل الليفية ملتصقة بلطف بالهز يدوياً قارورة للحد الأدنى 1</li>
			إزالة برنامج تلفزيوني <li>وإضافة التربسين 1 مل إلى قارورة. هز قارورة بلطف لضمان شمول جميع الخلايا ملتصقة التربسين. إزالة التربسين من قارورة. وضع في قارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية.</li>
			تأخذ قارورة خارج الحاضنة <li>وإضافة 10 مل RPMI 1640 المتوسطة إلى قارورة. "الماصة؛" المتوسط صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق الخلايا الليفية.</li>
			<li>"الماصة؛" 0.3 مل الليفية متناثرة على كل من هذين المجالين من الشريحة المجهر ووضع الشريحة في الحاضنة ل 24 ساعة حيث أن الخلايا الليفية الانضمام إلى الشريحة. ل immunostaining γH2AX و 53BP1 في نويات الخلايا الليفية، انتقل إلى الخطوة 3، 1-</li>
		</ol></li></ol></li> <li>عينات المرضى <ol><li>عينات الدم: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل الحل الأسهم التخثر وإضافة 7 مل الدم في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3)-</li>
		<li>عينات نخاع العظام: استخدام أنابيب جمع يتم ملؤها مع 2 مل من محلول الأسهم التخثر (الخطوة 1، 1) وإضافة 7 مل نخاع العظام في الأنابيب. تخزين العينات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (أي، 18-20 درجة مئوية). وفي اليوم التالي عزل مرحلة G0/G1 يستريح الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي (الخطوة 2.2.3). استخدام CD34 ميكروبيدس والخلية أعمدة الفصل لعزل الخلايا CD34 +-</li>
		<li>عزل الخلايا وحيدات النوى بكثافة التدرج الطرد المركزي 
		ملاحظة: الخلايا وحيدات النوى معزولة من عينات نخاع العظم والدم بكثافة الطرد المركزي التدرج 17 ، ، من 18 19.
		<ol><li>ديلوتى عينة الدم هيبارينيزيد بنسبة 1:1 مع برنامج تلفزيوني وعينه نخاع العظم هيبارينيزيد بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين.</li>
			إضافة <li>حجم متوسط الكثافة المتدرجة إلى أنبوب جديد. بلطف طبقة الدم المخفف أو نخاع العظام فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. الحرص على عدم خلط الطبقتين.</li>
			<li>الطرد المركزي في أنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س رسم طبقة البلازما العليا قبالة مع الماصة. ثم بعناية حصاد الخلايا وحيدات النوى في الطبقة فوق المتوسطة الكثافة المتدرجة. نقل الخلايا وحيدات النوى في أنبوب جديد.</li>
			إضافة <li>على الأقل ثلاثة مجلدات من برنامج تلفزيوني للخلايا وحيدات النوى في الأنبوب. تعليق الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين. الطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س</li>
			<li>بعد تدور إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من 4 درجة مئوية، 1 x حل تحلل للخلايا الحمراء. ريسوسبيند الخلايا بلطف عن طريق الرسم وخارجها الماصة مرتين، ووضع الأنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 30 مل برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية والطرد المركزي في أنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 غ. س</li>
		</ol></li> <li>إعداد سيتوسبينس <ol><li>إعداد سيتوسبينس اثنين مع الخلايا وحيدات النوى من عينات المرضى (أي، سيتوسبين واحد لتلطيخ الفلورة γH2AX وسيتوسبين واحد ل γH2AX و 53BP1 جنبا إلى جنب تلطيخ الفلورة) بالطرد المركزي (300 x ز، 10 دقيقة) 1.0 × 10 5 خلايا لكل إعداد ( الشكل 3 و 4)-</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3-γH2AX و "تلطيخ الفلورة" 53BP1 <ol><li>التثبيت وبيرميبيليزيشن: إصلاح الخلايا مع 200 ميليلتر من 4% منهاج العمل لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. ثم بيرميبيليزي الخلايا مع 200 ميليلتر من 0.1% 9 أوكتوكسينول للحد الأدنى 10 يغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من محلول حظر 5% لمدة كل 5 دقائق على شاكر معمل. كتلة الخلايا في 30 مل الطازجة 5% إعاقة الحل حاء – 1</li>
	<li>الحضانة مع الأجسام المضادة <ol><li>احتضان إعداد واحدة من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) وإعداد أخرى من الخلايا بجسم [مونوكلونل] مكافحة--γH2AX ماوس (1: 500) أرنب [بولكلونل] جسم المضادة-53BP1 (1: 500) بين عشية وضحاها في 4 ° C.</li>
		<li>بعد الاحتضان غسل الخلايا بلطف 3 مرات مع 30 مل محلول حظر 2% لكل 5 دقائق على شاكر مختبر.</li>
		<li>إزالة الحل حظر واحتضان إعداد الخلايا بجسم ماعز مترافق Alexa488 المضادة ماوس ثانوي (1: 500) الأولى والثانية إعداد الخلايا مع (المضادة ماوس ثانوي جسم ماعز مترافق Alexa488 1: 500) ودونكي Alexa555 مترافق أرنب المضادة ثانوية جسم (1: 500) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-</li>
	</ol></li> <li>المتوسطة التركيب: وضع الشريحة مع الخلايا في وعاء وغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع 30 مل من برنامج تلفزيوني لكل 5 دقائق على شاكر معمل. إزالة برنامج تلفزيوني وجبل الخلايا مع تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي. حذر وضع ساترة من فوق المتوسطة متصاعدة حيث تكون لا فقاعات الهواء المضمنة. الانتظار على الأقل 3 ح لتصلّب المتوسطة المتصاعدة قبل تحليل الخلايا بالميكروسكوب fluorescence.</li>
</ol> 4. تحليل γH2AX و 53BP1 البؤر <ol><li>المجهري Fluorescence: تحليل البؤر γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية مجهر الأسفار مزودة بمرشحات DAPI و 488 أليكسا Cy3 أثناء التصوير إلى هدف X 100 التكبير. تسجيل الصور مع كاميرا ومعالجة الصور مع برامج التصوير المناسبة.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل تكوين وإصلاح جهاز تسوية المنازعات في نطاق عريض من المجالات البحثية. معلمات الحرجة التي تؤثر على نتائج هذه التجارب هي مرحلة دورة الخلية، العوامل المستخدمة لتثبيت و permeabilization للخلايا، والاختيار من الأجسام المضادة، والأجهزة والبرمجيات من المجهر الأسفار.
وتجلى تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX تزايد أضعافاً مضاعفة الليفية العادي الخط الخلية نهدف. ظهرت بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة في G0/G1 ومراحل G2 بالمقارنة مع تلامس γH2AX عموم ال...

تلف الحمض النووي بشكل مستمر بالذاتية (مثلاً، الإجهاد النسخ المتماثل، الأنواع الأكسجين التفاعلية، وعدم استقرار جوهري للحمض النووي) وخارجية (مثلاً، الجذور الكيميائية، والتشعيع) مصادر (الشكل 1)1،2 ،،من34. بين الأضرار الحمض النووي، والحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (جهاز تسوية المنازعات) آفات خطيرة بصفة خاصة وقد تؤدي إلى موت الخلايا أو التسرطن. وقد تنشأ حوالي 50 جهاز تسوية المنازعات كل خلية ودورة الخلية5. في خلايا الثدييات، وضع جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) ونونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) كمسارات رئيسية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات (الشكل 2). الموارد البشرية يحدث في أواخر المرحلة S/G2 ويستخدم أخت سليمة تشروماتيد كقالب لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء. وبالمقارنة، نج نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون مطفرة كما يمكن إضافة زوج قاعدي أو مستأصل قبل ربط نهايات مكسورة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمارس من الانضمام إلى نهاية بديلة كآلية بطيئة مطفرة إصلاح احتياطية في حالة عوز نهيج6،7.
حمل جهاز تسوية المنازعات الفسفرة هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج مجباس حول كل جهاز تسوية المنازعات. البؤر النووية تشكل تسمى البؤر γH2AX ويمكن كشفها ب الفحص المجهري الفلورة8. ΓH2AX تشجع توظيف المزيد من البروتينات المراعية لجهاز تسوية المنازعات، وهو يشارك في الكروماتين يعيد البناء وإصلاح الحمض النووي، والإشارات تنبيغ9. كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، التحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة من الممكن، الذي أثبت في خطوط خلايا السرطان وعينات المرضى10،11، 12 , 13 , 14-53BP1 (البروتين p53 1) بروتين رئيسي آخر في التوسط لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. أنها تشارك في تجنيد المراعية لجهاز تسوية المنازعات البروتينات، مما يشير إلى نقطة تفتيش، وتشابك جهاز تسوية المنازعات تنتهي15. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 يلعب دوراً حاسما في اختيار مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. فإنه بتشغيل إصلاح جهاز تسوية المنازعات نحو نج بينما منعت16ساعة. قد يكون التحليل المتزامن ل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نظراً لمهام حقيقية γH2AX و 53BP1 في إصلاح جهاز تسوية المنازعات، وسيلة مفيدة لتحليل دقيق لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات.
هذه المخطوطة يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء الفحص المجهري الفلورة γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية. على وجه التحديد، يتم تطبيق التقنية في الخلايا الليفية العادي الخط الخلية نهدف، في الأشعة السينية المشع لمفاوية فرد صحية وفي CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تفاصيل الأسلوب هي أشارت في سياق النتائج المعروضة.

<table><tbody><tr><td>RPMI متوسط</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>متوسط لزراعة الخلايا</td></tr><tr>نسبة<td>الصوديوم الهيبارين</td><td>فارم</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; الهيبارين 5,000 وحدة دولية / مل</td></tr><tr><td>محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪</td> <td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>مكون من محلول مخزون مضاد للتخثر</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>وسيط لعزل الخلايا أحادية النواة</td></tr><tr><td>محلول التربسين 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>إنزيم لتفكك الخلايا الليفية في زراعة الخلايا</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>عزل خلايا السلف النخاعي CD34 +</td></tr><tr><td>شرائح المجهر التشخيصي</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>شرائح المجهر</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; أجهزة الطرد المركزي المنضدية&nbsp;</td></tr><tr><td>غطاء جهاز</td><td></td><td></td><td></td>Cytospin</tr><tr><td></td><td>غطاء Heraeus</td><td>76003422</td><td>للعمل بدون أنابيب صغيرة</td></tr><tr><td>حاوية Cyto</td><td>حاوية Heraeus</td><td>75003416</td><td>Cyto مع 2 تجاويف مخروطية</td></tr><tr><td>حامل مشبك</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Carrier لحمل حاوية cyto وشريحة</td></tr><tr><td>دعم إدراج</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>إدراج الدعم ل حمل حامل مشبك</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>منظف لنفاذية أغشية الخلايا</td></tr><tr><td>محلول هيدروكسيد البوتاسيوم 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>ضروري لتحضير محلول بارافورمالدهايد</td></tr><tr><td></td><td>سيجما-ألدريتش</td><td>P6148</td><td>عامل التثبيت</td></tr><tr><td>محلول ملحي مخزن فوسفات</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>D8537</td><td>محلول ملح متوازن</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>عامل حجب</td></tr><tr><td>الماوس أحادي النسيلة مضاد جاما ؛ الجسم المضاد H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>الجسم المضاد الأساسي للكشف عن & جاما ؛ H2AX</td></tr><tr><td>الأرنب متعدد النسيلة المضاد للجسم المضاد 53BP1 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>الجسم المضاد الأساسي للكشف عن 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 مترافق الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>الجسم المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 المترافق الحمار المضاد للأرانب</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td> الجسم <td>المضاد الثانوي</td></tr><tr><td>Vectashield تصاعد الوسط</td> يحتوي <td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>على DAPI لتلوين DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Zeiss</td><td>490035</td><td>المجهر الفلوري</td></tr><tr><td>Cool Cube 1 CCD Camera</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td> نظام <td>الكاميرا للتسجيل الرقمي</td></tr><tr><td>برنامج Isis</td><td>Metasystems</td><td>غير قابل للتطبيق</td><td>برنامج المجهر</td></tr></tbody></table>

مجهر الفلورة γh2ax و 53bp1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (جهاز تسوية المنازعات) خطيرة الحمض النووي آفات. تحليل لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات ذات الصلة بطائفة واسعة من مجالات البحوث بما في ذلك سلامة الجينوم وسمية جينية وبيولوجيا الإشعاع، والشيخوخة، والسرطان وتطوير العقاقير. ردا على جهاز تسوية المنازعات، هو فوسفوريلاتيد هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج ميجاباسي تشكيل بؤر النووية منفصلة يمكن كشفها بالفحص المجهري الفلورة. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 (البروتين p53 1) آخر بروتين المراعية لجهاز تسوية المنازعات الهامة تعزيز إصلاح جهاز تسوية المنازعات قبل نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية بينما تمنع جزئ مثلى. وفقا للمهام المحددة في γH2AX و 53BP1، قد يكون الجمع بين تحليل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نهجاً معقولاً لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة وتستكمل مع ملاحظات منهجية لأداء التقنية. على وجه التحديد، يتضح تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX الليفية العادي الخط الخلية نهدف. علاوة على ذلك، يبين قيمة البؤر γH2AX كالعلامات البيولوجية لمفاوية المشع بالأشعة السينية لشخص سليم. وأخيراً، عدم الاستقرار الوراثي هو التحقيق في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد مجهرية الفلورة γH2AX و 53BP1.

تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا الأكثر دقة في مرحلة G0/G1 و G2 عند ظهور بؤر γH2AX كنقاط مضيئة مميزة (الشكل 5A). على النقيض من ذلك، تحليل للبؤر γH2AX في الخلايا أثناء مرحلة ثانية يعقدها تلامس مشتتة γH2AX عموم النووية الناجمة عن عملية النسخ المتماثل (الشكل 5 (ب)).
تم إجراء تثبيت الخلايا مع 4% منهاج عمل بيجين (10 دقيقة) وبيرميبيليزيشن مع 0.1% 9 أوكتوكسينول (10 دقيقة). يمكن اس...

هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

الهدف العام من الفحص المجهري المناعي gamma-H2AX و 53BP1 هو تحليل تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة في الأنسجة المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث السرطان ، مثل كيفية ظهور عدم الاستقرار الجيني في الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور فواصل الحمض النووي المزدوج ، ويمكن تحليل عمليات الإصلاح.ستظهر الإجراء سوزان بريندل ، فنية في مختبرنا. ابدأ التجربة بإعداد المحاليل ، بدءا بمحلول المخزون المضاد للتخثر مع 200 وحدة دولية من الهيبارين لكل مليلتر في 0.9 في المائة من كلوريد الصوديوم. املأ كل أنبوب من أنابيب التجميع بملليلترين من محلول مخزون مضاد للتخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التحلل 10X للخلايا الحمراء مع 82.91 جراما من كلوريد الأمونيوم ، و 7.91 جراما من بيكربونات الأمونيوم ، ومليلترين من محلول حمض الإيثيلين diamenetetracedic 0.5 مولار إلى درجة حموضة 8.0 عن طريق إذابة العوامل في الماء المقطر المزدوج لحجم إجمالي يبلغ لتر واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التثبيت بإضافة 8.3 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم المولي الواحد إلى 360 ملليغرام من بارافورمالدهيد ، أو PFA ، في أنبوب ميكروتيتر. املأ الأنبوب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، إلى علامة المليلتر الواحد للأنبوب وقم بتسخين الأنبوب في كتلة تسخين عند 95 درجة مئوية للحصول على مليلتر واحد من محلول PFA بنسبة 36 في المائة.انقل المليلتر الواحد من محلول PFA بنسبة 36 في المائة إلى أنبوب سعة 15 مل. وأضف ثمانية ملليلتر من PBS للحصول على محلول مخزون PFA بنسبة تسعة ملليلتر وأربعة في المائة. قم بتخزين محلول مخزون PFA بنسبة 4 في المائة وقم بتخزينه عند سالب 18 درجة مئوية حتى استخدامه لتثبيت الخلايا.بعد ذلك ، قم بإعداد محلول النفاذية عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من Octoxynol 9 إلى 50 مل من PBS للحصول على محلول يبلغ حوالي 0.1 في المائة Octoxynol 9. أخيرا ، قم بإعداد محاليل حجب بنسبة خمسة في المائة واثنين في المائة عن طريق خلط عامل حجب البروتين مع PBS. لتحضير عينات الدم أو نخاع العظم ، استرجع الأنابيب المملوءة بملليلترين من محلول مخزون مضاد التخثر.سحب سبعة ملليلتر من الدم أو نخاع العظم لكل أنبوب في ظروف معقمة عن طريق البزل الوريدي أو ثقب نخاع العظم على التوالي. قم بتخزين العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد التخزين طوال الليل ، قم بتخفيف عينة الدم المهيبدين واحدا إلى واحد باستخدام PBS وعينة نخاع العظم الهيباريني بنسبة واحد إلى ثلاثة باستخدام PBS.قم بتعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وإخراجها مرتين. بعد ذلك ، أضف حجما واحدا من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب جديد. ضع طبقة من الدم المخفف أو نخاع العظم برفق فوق وسط تدرج الكثافة واحرص على عدم خلط الطبقتين.قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 جم ، اسحب طبقة البلازما العلوية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا أحادية النواة بعناية في الطبقة فوق وسط تدرج الكثافة. انقل الخلايا أحادية النواة إلى أنبوب جديد وأضف ثلاثة أحجام على الأقل من PBS.قم بتعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وإخراجها مرتين. الطرد المركزي الأنبوب. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية.أضف 10 ملليلتر من أربع درجات مئوية 1x محلول تحلل للخلايا الحمراء. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وخارجها مرتين ووضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم أضف 30 مل من PBS عند أربع درجات مئوية وقم بالطرد المركزي للأنبوب.استخدم حبات CD34 الدقيقة وأعمدة فصل الخلايا لعزل الخلايا الإيجابية CD34. تحضير اثنين من الدورات الخلوية مع الخلايا أحادية النواة من عينات المريض عن طريق الطرد المركزي من واحد في 10 الخلايا الخمس لكل مستحضر. قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من أربعة في المائة PFA لمدة 10 دقائق.بعد التثبيت ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1 في المائة Octoxynol 9 لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع بنسبة خمسة في المائة لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر المختبر.قم بسد الخلايا في 30 مل من محلول حجب طازج بنسبة خمسة في المائة لمدة ساعة واحدة. يحافظ تثبيت الخلايا ونفاذيتها بنسبة أربعة في المائة بارافورمالدهيد في 0.1 في المائة من Octoxynol 9 على بؤر gamma-H2AX و 53BP1 بشكل واضح. احتضان مستحضر واحد من الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX والآخر للخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX وجسم مضاد للأرنب متعدد النسيلة مضاد ل 53BP1 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.يوصى بشدة باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Gamma-H2AX و 53BP1 المثبتة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول حجب بنسبة 2 في المائة لكل خمس دقائق على شاكر المختبر. بعد ذلك ، احتضان المستحضر الأول للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa 488 مخفف واحد من كل 500 في محلول مانع بنسبة اثنين في المائة.احتضان المستحضر الثاني للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa 488 وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من Alexa 555 مخفف واحد من كل 500 في محلول مانع بنسبة 2 في المائة. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS على شاكر المختبر. قم بإزالة PBS وقم بتركيب الخلايا بوسيط تثبيت.ضع بحذر زلة غطاء أعلى وسط التثبيت حتى لا يتم تضمين فقاعات هواء. انتظر ثلاث ساعات على الأقل حتى يتصلب وسط التركيب قبل تحليل الخلايا بواسطة الفحص المجهري الفلوري. أخيرا ، قم بتحليل بؤر gamma-H2AX و 53BP1 في نوى الخلية باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات ل DAPI و Alexa 488 و Cy3 أثناء التصوير بتكبير 100x objected.يكون تحليل بؤر جاما-H2AX في الخلايا أكثر دقة في المرحلة G0 و G1 والمرحلة G2 عندما تظهر بؤر جاما-H2AX كنقاط فلورية مميزة كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية للأرومات الليفية. في المقابل ، فإن تحليل بؤر جاما-H2AX في الخلايا خلال المرحلة S معقد بسبب بقع جاما-H2AX المشتتة الناتجة عن عملية النسخ المتماثل. تم استخدام تلطيخ التألق المناعي ل gamma-H2AX لقياس فواصل الحمض النووي المزدوجة في الأنسجة المشعة وأوضح أن مستويات بؤر جاما-H2AX في الخلايا الليمفاوية المشعة تتناسب مع جرعة التشعيع.يشير التوطين المشترك لبؤر جاما-H2AX و 53BP1 في الخلايا الإيجابية CD34 لمريض مصاب بابيضاض الدم النخاعي الحاد إلى تعزيز آليات إصلاح الربط النهائي غير المتماثلة بوساطة 53BP1 في مواقع فواصل الخيوط المزدوجة للحمض النووي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص المجهري المناعي gamma-H2AX و 53BP1 لتحليل فواصل الحمض النووي المزدوج. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف المناعي لأجهزة الصراف الآلي المرتبطة بالفوسفور و ATR و نقطة التفتيش كيناز واحد ونقطة التفتيش كيناز الثانية و TP53 في الخلايا السرطانية من أجل تحليل التغيرات في استجابة تلف الحمض النووي.

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

أبحاث السرطان

لقد أصبح القياس الكمي للالشرائط المزدوج حبلا الحمض النووي باستخدام تشكيل γH2AX كعلامة الجزيئية أداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي للالكمي للبؤر γH2AX بعد التعرض للإشعاع من الخلايا.

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

لقد أصبح من الكميات فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي على أساس من بؤر γH2AX أداة لا تقدر بثمن ، لا سيما في مجال البيولوجيا الإشعاعية ، لتقييم حساسية للأشعة الأنسجة وآثار الاشعاع تعديل المركبات. نحن هنا لشرح استخدام للمقايسة التألق المناعي عن الكميات من بؤر γH2AX في عينات الأنسجة.

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

وقد أصبح التحليل المجهري للبؤر γH2AX ، والتي تشكل في أعقاب الفسفرة من H2AX في سر - 139 ردا على فواصل المزدوج حبلا الحمض النووي ، وأداة لا تقدر بثمن في مجال البيولوجيا الإشعاعية. المستخدمة هنا نحن جسم مضاد لأحادية ميثليته H3 هيستون في ليسين (4) وعلامة جينية من كروماتين حقيقي بنشاط الاختزال ، لتقييم التوزيع المكاني للتشكيل γH2AX الإشعاع الناجم داخل النواة.

تقييم التوزيع المكاني للγH2AX التالية الإشعاعات المؤينة

في هذا الفيديو ، نصف طريقة التألق المناعي لتصور توطين بروتينات إصلاح الحمض النووي γH2AX و 53BP1 في مواقع فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط في نوى الخلايا المشععة.

التصور القائم على التألق المناعي لتفاعلات بروتين إصلاح الحمض النووي

في هذا الفيديو ، نصف تقنية الفحص المجهري المناعي الفلوري للكشف عن بروتينات استجابة تلف الحمض النووي المحددة في مواقع فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا البشرية أحادية النواة. يتم التعرف على البروتينات بواسطة أجسام مضادة أولية محددة ، والتي بدورها ترتبط بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي تتألق أثناء التصور المجهري ، مما يتيح تصور البروتينات كبؤر فلورية مميزة داخل نوى الخلية.

الفحص المجهري المناعي الفلوري لتحليل فواصل الحمض النووي المزدوجة

دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.

التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع

إصلاح فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي عملية دينامية، تتطلب ليس فقط تشكيل مجمعات إصلاح فواصل، ولكن أيضا على القرار بعد معالجة الآفة. هنا، نستخدم مجهرية الفلورة لفواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل عابرة وطويلة الأمد كأداة لتشريح هذه الآلية صيانة الجينوم.

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

لم يتم بشكل كامل تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن البؤر الناجمة عن الإشعاع (RIF) من البروتينات الإصلاح عن طريق تلطيخ المناعة في خطوط خلايا سرطان القولون البشرية بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط.

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

بعد تلف الحمض النووي، تقوم الخلايا البشرية بتنشيط مسارات الإصلاح الأساسية لاستعادة سلامة جينومها. هنا، نحن وصف طريقة من المناعة غير المباشرةflufluorescence كوسيلة للكشف عن البروتينات إصلاح الحمض النووي، وتحليل توظيفها المكانية والزمانية، والمساعدة في استجواب التفاعل البروتين البروتيني في مواقع الضرر الحمض النووي.

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة من خلال الكشف المتزامن عن بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الطور البيني للخلايا الليمفاوية الطرفية البشرية المعالجة بالبليوميسين.

التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا وسريعا للكشف عن تفاعل البروتين في مواقع تلف الحمض النووي.

مقايسة ترابط القرب لتوطين البروتينات في مواقع تلف الحمض النووي

تعلم مجهر الفلورة المناعي لـ γH2AX و53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا السرطانية. هذه التقنية تُمكّن الباحثين من تصور أضرار الحمض النووي الفردية ودراسة آليات عدم الاستقرار الوراثي.

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

استكشف المزيد من الفيديوهات