مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

الهدف العام من الفحص المجهري المناعي gamma-H2AX و 53BP1 هو تحليل تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة في الأنسجة المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث السرطان ، مثل كيفية ظهور عدم الاستقرار الجيني في الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور فواصل الحمض النووي المزدوج ، ويمكن تحليل عمليات الإصلاح.

ستظهر الإجراء سوزان بريندل ، فنية في مختبرنا. ابدأ التجربة بإعداد المحاليل ، بدءا بمحلول المخزون المضاد للتخثر مع 200 وحدة دولية من الهيبارين لكل مليلتر في 0.9 في المائة من كلوريد الصوديوم. املأ كل أنبوب من أنابيب التجميع بملليلترين من محلول مخزون مضاد للتخثر قبل سحب عينات الدم أو نخاع العظم.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التحلل 10X للخلايا الحمراء مع 82.91 جراما من كلوريد الأمونيوم ، و 7.91 جراما من بيكربونات الأمونيوم ، ومليلترين من محلول حمض الإيثيلين diamenetetracedic 0.5 مولار إلى درجة حموضة 8.0 عن طريق إذابة العوامل في الماء المقطر المزدوج لحجم إجمالي يبلغ لتر واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول التثبيت بإضافة 8.3 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم المولي الواحد إلى 360 ملليغرام من بارافورمالدهيد ، أو PFA ، في أنبوب ميكروتيتر. املأ الأنبوب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، إلى علامة المليلتر الواحد للأنبوب وقم بتسخين الأنبوب في كتلة تسخين عند 95 درجة مئوية للحصول على مليلتر واحد من محلول PFA بنسبة 36 في المائة.

انقل المليلتر الواحد من محلول PFA بنسبة 36 في المائة إلى أنبوب سعة 15 مل. وأضف ثمانية ملليلتر من PBS للحصول على محلول مخزون PFA بنسبة تسعة ملليلتر وأربعة في المائة. قم بتخزين محلول مخزون PFA بنسبة 4 في المائة وقم بتخزينه عند سالب 18 درجة مئوية حتى استخدامه لتثبيت الخلايا.

بعد ذلك ، قم بإعداد محلول النفاذية عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من Octoxynol 9 إلى 50 مل من PBS للحصول على محلول يبلغ حوالي 0.1 في المائة Octoxynol 9. أخيرا ، قم بإعداد محاليل حجب بنسبة خمسة في المائة واثنين في المائة عن طريق خلط عامل حجب البروتين مع PBS. لتحضير عينات الدم أو نخاع العظم ، استرجع الأنابيب المملوءة بملليلترين من محلول مخزون مضاد التخثر.

سحب سبعة ملليلتر من الدم أو نخاع العظم لكل أنبوب في ظروف معقمة عن طريق البزل الوريدي أو ثقب نخاع العظم على التوالي. قم بتخزين العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد التخزين طوال الليل ، قم بتخفيف عينة الدم المهيبدين واحدا إلى واحد باستخدام PBS وعينة نخاع العظم الهيباريني بنسبة واحد إلى ثلاثة باستخدام PBS.

قم بتعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وإخراجها مرتين. بعد ذلك ، أضف حجما واحدا من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب جديد. ضع طبقة من الدم المخفف أو نخاع العظم برفق فوق وسط تدرج الكثافة واحرص على عدم خلط الطبقتين.

بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 جم ، اسحب طبقة البلازما العلوية باستخدام ماصة. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا أحادية النواة بعناية في الطبقة فوق وسط تدرج الكثافة. انقل الخلايا أحادية النواة إلى أنبوب جديد وأضف ثلاثة أحجام على الأقل من PBS.

قم بتعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وإخراجها مرتين. الطرد المركزي الأنبوب. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية.

أضف 10 ملليلتر من أربع درجات مئوية 1x محلول تحلل للخلايا الحمراء. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحبها داخل الماصة وخارجها مرتين ووضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم أضف 30 مل من PBS عند أربع درجات مئوية وقم بالطرد المركزي للأنبوب.

استخدم حبات CD34 الدقيقة وأعمدة فصل الخلايا لعزل الخلايا الإيجابية CD34. تحضير اثنين من الدورات الخلوية مع الخلايا أحادية النواة من عينات المريض عن طريق الطرد المركزي من واحد في 10 الخلايا الخمس لكل مستحضر. قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من أربعة في المائة PFA لمدة 10 دقائق.

بعد التثبيت ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1 في المائة Octoxynol 9 لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع بنسبة خمسة في المائة لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر المختبر.

قم بسد الخلايا في 30 مل من محلول حجب طازج بنسبة خمسة في المائة لمدة ساعة واحدة. يحافظ تثبيت الخلايا ونفاذيتها بنسبة أربعة في المائة بارافورمالدهيد في 0.1 في المائة من Octoxynol 9 على بؤر gamma-H2AX و 53BP1 بشكل واضح. احتضان مستحضر واحد من الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX والآخر للخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر H2AX وجسم مضاد للأرنب متعدد النسيلة مضاد ل 53BP1 بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.

يوصى بشدة باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Gamma-H2AX و 53BP1 المثبتة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول حجب بنسبة 2 في المائة لكل خمس دقائق على شاكر المختبر. بعد ذلك ، احتضان المستحضر الأول للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa 488 مخفف واحد من كل 500 في محلول مانع بنسبة اثنين في المائة.

احتضان المستحضر الثاني للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa 488 وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من Alexa 555 مخفف واحد من كل 500 في محلول مانع بنسبة 2 في المائة. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS على شاكر المختبر. قم بإزالة PBS وقم بتركيب الخلايا بوسيط تثبيت.

ضع بحذر زلة غطاء أعلى وسط التثبيت حتى لا يتم تضمين فقاعات هواء. انتظر ثلاث ساعات على الأقل حتى يتصلب وسط التركيب قبل تحليل الخلايا بواسطة الفحص المجهري الفلوري. أخيرا ، قم بتحليل بؤر gamma-H2AX و 53BP1 في نوى الخلية باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات ل DAPI و Alexa 488 و Cy3 أثناء التصوير بتكبير 100x objected.

يكون تحليل بؤر جاما-H2AX في الخلايا أكثر دقة في المرحلة G0 و G1 والمرحلة G2 عندما تظهر بؤر جاما-H2AX كنقاط فلورية مميزة كما هو موضح في هذه الصورة التمثيلية للأرومات الليفية. في المقابل ، فإن تحليل بؤر جاما-H2AX في الخلايا خلال المرحلة S معقد بسبب بقع جاما-H2AX المشتتة الناتجة عن عملية النسخ المتماثل. تم استخدام تلطيخ التألق المناعي ل gamma-H2AX لقياس فواصل الحمض النووي المزدوجة في الأنسجة المشعة وأوضح أن مستويات بؤر جاما-H2AX في الخلايا الليمفاوية المشعة تتناسب مع جرعة التشعيع.

التوطين المشترك لبؤر جاما-H2AX و 53BP1 في الخلايا الإيجابية CD34 لمريض مصاب بابيضاض الدم النخاعي الحاد إلى تعزيز آليات إصلاح الربط النهائي غير المتماثلة بوساطة 53BP1 في مواقع فواصل الخيوط المزدوجة للحمض النووي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الفحص المجهري المناعي gamma-H2AX و 53BP1 لتحليل فواصل الحمض النووي المزدوج. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل النشاف المناعي لأجهزة الصراف الآلي المرتبطة بالفوسفور و ATR و نقطة التفتيش كيناز واحد ونقطة التفتيش كيناز الثانية و TP53 في الخلايا السرطانية من أجل تحليل التغيرات في استجابة تلف الحمض النووي.