قياس مرونة للصحفيين طرحه باستخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح)

العام لهذا النظام هو السماح بالمراقبة السهلة للمراسلين المضيء بيولوجيا في ظل مجموعة واسعة من الظروف خارج الخلية بما في ذلك في ظل التروية المستمرة للوسائط. يمكن استخدام هذه الطريقة لمراقبة التلألؤ البيولوجي طوليا من الخلايا والأنسجة المستنبتة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتسجيل من الخلايا في ظل ظروف مختلفة خارج الخلية والغاز وهو أمر غير ممكن في معظم الأنظمة الموجودة.

على الرغم من أننا نوضح هذه التقنية هنا في سياق تجارب إيقاع الساعة البيولوجية ، إلا أنه يمكن تطبيقها بسهولة على الأنظمة الأخرى التي تتطلب تلألؤ بيولوجيا أو تسجيل فلوري على مدى نطاقات زمنية من أيام إلى أسابيع. لبدء الإجراء ، زرع البذور الخلايا على أطباق أو أطباق زراعة الأنسجة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تصل الطبقات الأحادية إلى التقاء 100٪.

قبل التجربة مباشرة ، استخدم حاضنة ركوب الدراجات التي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر للتناوب بين 32 و 37 درجة مئوية كل 12 ساعة لمدة 72 ساعة على الأقل لمزامنة الإيقاعات الخلوية. يعد التزامن القوي للتذبذبات اليومية الخلوية داخل الثقافات وفيما بينها أمرا بالغ الأهمية للتكاثر التجريبي. نحقق ذلك من خلال تطبيق دورات درجة الحرارة اليومية قبل كل تسجيل تقوم بمزامنة الخلايا عن طريق محاكاة إيقاعات درجة حرارة الجسم.

بدلا من ذلك ، يمكن أن يكون التزامن الدوائي فعالا أيضا. بعد ذلك ، امزج 8.3 جرام من مسحوق DMEM عالي الجلوكوز مع 900 مل من الماء عالي النقاء. قلب المحلول لمدة 30 دقيقة لإذابة المسحوق تماما.

ثم أضف إلى المحلول 50 مل من محلول الجلوكوز 100 جرام لكل لتر ، و 20 مل من الرقم الهيدروجيني 7.6 ، ومحلول MOPS مولاري واحد و 10 ملليلتر من محلول الستربتومايسين البنسلين 100 مرة. قلب الخليط لمدة 10 دقائق. ثم أضف 4.7 مل من محلول بيكربونات الصوديوم 7.5٪ وحرك الخليط لمدة خمس دقائق أخرى.

استخدم حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.6 في درجة حرارة الغرفة. أضف الماء عالي النقاء إلى المحلول لتحقيق حجم نهائي يبلغ لتر واحد. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.22 ميكرومتر في قارورة معقمة.

قم بتخزين وسط المرق المصفى عند أربع درجات مئوية. قبل إجراء التجربة مباشرة ، استكمل الكمية المطلوبة من وسط المرق بمصل 10٪ ، ومليمولار GlutaMAX ، و 2٪ NS21 ومليمولار واحد من لوسيفيرين. مرر وسط العمل الناتج من خلال مرشح معقم 0.22 ميكرومتر.

استخدم محلولا خماسيا من كلوريد الصوديوم لضبط أسمولية وسط العمل إلى 350 مللي أوسمول. ثم قم بتسخين الوسط إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. بعد ذلك ، لبدء تركيز كاميرا حاضنة التلألؤ الحيوي ، قم بفك مرشح الكثافة المحايدة غير المنفذة للمياه.

في برنامج الجهاز، اضبط وقت التعرض على 0.2 ثانية ووقت الدورة الحركية على 0.3 ثانية. تحقق من إيقاف تشغيل كسب مضاعفة الإلكترون ، ثم أغلق نافذة الإعداد وابدأ تسجيل الفيديو. استخدم أسطوانة التركيز البؤري لتدوير عدسة الكاميرا حتى يتم التركيز البؤري بوضوح على عناصر الاختبار الموجودة على رف العينة المناسب.

ثم أوقف تسجيل الفيديو. استبدل مرشح الكثافة المحايدة وقم بإزالة عناصر الاختبار. بعد ذلك ، استخدم لوحة التحكم الموجودة في مقدمة حاضنة التلألؤ الحيوي لضبط مستويات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون ودرجة الحرارة المطلوبة للتجربة.

لتجربة رطبة ، املأ صينية الماء في قاعدة الحاضنة. قم بإزالة الخلايا من حاضنة زراعة الأنسجة واستبدل وسط الثقافة بوسط العمل الدافئ مسبقا. للتجارب المرطبة باستخدام كميات صغيرة ، أغلق الألواح بغشاء أو شريط منفذ للغاز.

ضع الألواح في الحاضنة المضيئة الحيوية. أغلق الحاضنة واربط غطاء الباب لاستبعاد الضوء من النظام. ثم ، في برنامج الأداة ، اضبط وضع الاستحواذ على الحركية.

اضبط وقت التعريض الضوئي المطلوب. اضبط التراكمات على طول سلسلة حركية واحدة إلى العدد المطلوب من دورات الاستحواذ ووقت الدورة الحركية إلى الفاصل الزمني المطلوب للتصوير. قم بتعيين سرعة تحول تبلغ 4.33 ميكروثانية ، وكسب واحد وكسب EM للمستوى المطلوب.

بعد ذلك، قم بتعيين نوع ملف الحفظ التلقائي إلى sif أو tiff. قم بتسمية ملف الحفظ التلقائي وتعيين مسار الملف الخاص به. قم بتعيين نوع ملف التخزين المؤقت إلى sif أو tiff.

قم بتسمية مكدس الملفات وتعيين مسار الملف الخاص به. أغلق نافذة الإعداد وابدأ في تسجيل البيانات. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات ، قم باستيراد مكدس الصور المكتسبة إلى برنامج معالجة الصور.

اضبط السطوع والتباين للحصول على عرض مثالي للتلألؤ البيولوجي. ثم حدد مناطق الاهتمام وقم بتصدير متوسط الإشارة للمناطق المحددة. انسخ البيانات إلى برنامج تحليل لمزيد من المعالجة.

لبدء التجربة ، خلايا البذور على شرائح أحادية القناة مع موصلات Luer وعمق قناة 0.6 أو 0.8 ملم. ثقافة وتدريب الخلايا. تحضير وتدفئة كربونات الهيدروجين مخزن منخفض الجلوكوز DMEM التروية متوسطة.

بعد ذلك ، قم بقطع خمسة أقسام بطول سنتيمترين من أنابيب السيليكون بقطر داخلي يبلغ ملليمتر واحد. قطع 1.2 متر و 10 سم و 30 سم من أنابيب الإيثيلين رباعي فلورو إيثيلين ذات القطر الداخلي المليمتر الواحد. تعقيم الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول وغسل الأنبوب باستخدام PBS معقم.

استخدم أنابيب السيليكون المعقمة لتوصيل أنبوب ETFE الذي يبلغ طوله 1.2 متر بموصل Luer أنثوي معقم وموصل Luer معقم. استخدم هذه المجموعة لتوصيل حقنة التروية المتوسطة بشريحة قناة Luer فارغة. بعد ذلك ، استبدل وسط زراعة الخلية بوسط التروية الدافئ مسبقا.

املأ حقنة معقمة سعة 20 مليلتر بوسط تروية مسخن مسبقا. قم بتركيب أنبوب ETFE الذي يبلغ طوله 10 سم مع موصلات Luer باستخدام أنبوب السيليكون وقم بتوصيل الأنبوب بالشريحة. اغسل ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من وسط التروية من خلال الأنبوب وانزلاق القناة.

بعد ذلك ، قم بتركيب أنبوب ETFE الذي يبلغ طوله 30 سم على شريحة القناة المحتوية على الخلية. قم بتوصيل الطرف الحر لأنبوب ETFE الذي يبلغ طوله 10 سم بالطرف الآخر من شريحة قناة الخلية لتشكيل نظام التروية الكامل. اغسل ملليلتر واحد من وسط التروية عبر الأنبوب والشرائح لاستبعاد فقاعات الهواء.

نقل نظام التروية إلى حاضنة التلألؤ الحيوي. قم بتأمين حقنة التروية المملوءة بمتوسط في مضخة حقنة مع الحرص على عدم فصل الأنبوب. استخدم مضخة الحقنة لشطف مليلتر واحد من وسط التروية من خلال نظام التروية.

أدخل قطر المحقنة على المضخة ، واضبط معدل التدفق على 50 ميكرولتر في الساعة. من الأهمية بمكان عدم وجود فقاعات في نظام التروية في بداية التجربة لأنها يمكن أن تعطل إشارة التلألؤ الحيوي. ابدأ تشغيل المضخة وأغلق باب حاضنة التلألؤ الحيوي على الفور.

اربط غطاء الباب لاستبعاد الضوء من النظام. الحصول على البيانات وتحليلها كما هو موضح لمزارع الأنسجة الساكنة. تم تثبيت ستة صفائح من الخلايا الليفية PER2 LUC باستخدام دورات درجة الحرارة اليومية وتم تصويرها باستخدام حاضنة تلألؤ بيولوجي.

تم تحليل الصور من آبار مختارة وتم تحديد ناتج التلألؤ البيولوجي. تم تصوير خلايا PER2 LUC أيضا في ظل ظروف التروية لتقييم تأثيرات مثبط كيناز الكازين على تعبير PER2 LUC. تمت مقارنة النتائج بالخلايا المعالجة بنفس تركيز المثبط في ظل ظروف ثابتة كشفت عن إطالة فترة أكبر بكثير في ظل ظروف ثابتة.

تم العثور على حجم فترة إطالة في ظل ظروف التروية قريب من ذلك الذي لوحظ في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجارب التلألؤ البيولوجي الثابتة والمنفخة باستخدام التمساح.