سير عمل شامل للتعرف على نطاق الجينوم والتحليل التلوي التعبير الأسرة الجينات ATL E3 Ubiquitin ليجاسى في الكرمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق توصيف شامل لعائلة جينية في النباتات لنهج عالمي بما في ذلك تعريف بنية الجينات ، وزخارف البروتين المعنية ، وموقع الكروموسومات ، وازدواجية الجينات ، وأنماط التعبير. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تصنيف النباتات في العائلات مثل التحديد الجيني العالمي لأفراد الأسرة ويوفر نسخهم ذلك من خلال تحليل التعبير الجيني. تتمثل الميزة الرئيسية للإجراء بأكمله في توفير قائمة شاملة من الخطوات التجريبية لتحقيق توصيف كامل لعائلة الجينات.

يمكن تطبيق هذا الإجراء على أي عائلة جينية من أي نوع نباتي تتوفر بيانات جينية عنه. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النهج معلومات قيمة لتحديد المرشحين المثيرين للاهتمام للدراسات الوظيفية. وسيكون بيترو أرياني من مختبري يعرض الإجراء برمته.

افتح صفحة الويب Blast وانقر على قسم انفجار البروتين. في حقل تسلسل الاستعلام أدخل ، أدخل تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين الذي سيتم استخدامه كمسبار لتحديد أفراد الأسرة الآخرين. استخدم بروتينا يحتوي على جميع الميزات المهمة التي تميز الأسرة.

بعد ذلك ، في الحقل ، اختر مجموعة البحث ، وحدد قاعدة بيانات البروتين المرجعية والكائن الحي المعني. الآن ، في تحديد البرنامج الميداني ، حدد خوارزمية PSI-BLAST. إذا رغبت في ذلك ، انقر فوق معلمات الخوارزمية لضبط المعلمات المتقدمة مثل الحد الأقصى لتسلسل الهدف ومصفوفة التسجيل.

القيمة E هي العتبة التي يتم تخفيضها لهذا البحث من 005 إلى 001. انقر فوق الزر BLAST لتشغيل التحليل. من بين جميع التسلسلات التي تعرض التطابقات النسبية للاستعلام ، قم بإلغاء تحديد الإدخالات التي من الواضح أنها لا تنتمي إلى العائلة.

افعل ذلك بالنقر فوق علامة الاختيار في عمود تحديد PSI-BLAST. بعد ذلك ، قم بتشغيل تكرار PSI-BLAST ثان بالنقر فوق الزر انتقال. سيتم تمييز جميع التسلسلات المحددة حديثا باللون الأصفر.

مرة أخرى ، قم بإلغاء تحديد الزيارات التي لا تنتمي إلى العائلة. استمر في هذه العملية حتى لا تجد الخوارزمية أي إدخال ذي صلة أو تصل إلى التقارب. بمجرد التخلص من جميع الإيجابيات الكاذبة ، اجمع التسلسلات الحمضية الأمينية في ملف بتنسيق FASTA وقم بتحميل الملف في مجموعة برامج المعلوماتية الحيوية.

بعد ذلك ، حدد جميع التسلسلات المستوردة في القائمة وانقر فوق الزر محاذاة / تجميع في شريط الأدوات. ثم انقر فوق المحاذاة المتعددة الحكيمة المزدوجة وحدد محاذاة العضلات وموافق. سيتم الآن إجراء المحاذاة باستخدام الإعدادات الافتراضية. الآن تصور شعار تسلسل المحاذاة وافحص الجينات بصريا للبحث عن الإيجابيات الكاذبة.

يتم وصف مزيد من التحليل للمعلمات والمجالات الفيزيائية للبروتين ، وتوزيع الكروموسومات ، والازدواجية ، وتنظيم exon intron في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتحليل العلاقات بين أفراد عائلة ATL من خلال بناء شجرة النشوء والتطور عالية الجودة وتحديد تسمية العائلة. أولا ، استرجع العربي يعتمد systeliana تسلسلات ATL ، المطلوبة كمراجع لتسميات جينات كرمة العنب ، من قاعدة بيانات UmoProt للرجوع إليها.

ثم قم بعمل ملف FASTA يتضمن جميع تسلسلات النيوكليوتيدات لكرمة العنب وأعضاء عائلة جين نبات الأرابيدوبسيس لتحليل النشوء والتطور. تصفح الآن الصفحة الرئيسية ل phylogeny France وحدد خط أنابيب تحليل النسالة. نقرة واحدة مناسبة في معظم الحالات ، ولكن إذا لزم الأمر ، من الممكن تحديد إعدادات متقدمة محددة باستخدام الخيارات المتقدمة أو حتى تحليل مخصص بالكامل باستخدام الخيارات الانتقائية.

بعد ذلك ، أدخل اسما للتحليل وقم بتحميل ملف FASTA. ثم انقر فوق إرسال لتشغيل التحليل. إذا نتج عن هذا الإجراء رسالة خطأ، فأكمل كل خطوة من خطوات خط أنابيب مجموعة السلالات على حدة.

أولا ، انتقل إلى الصفحة الرئيسية لبرنامج MUSCLE وقم بتحميل ملف FASTA. حدد Pearson FASTA كتنسيق إخراج وإرساله. بعد ذلك ، قم بتنزيل الملف بتنسيق FASTA وتخلص من أي مواضع ضعيفة المحاذاة.

افتح أداة خادم G-block ، وقم بتحميل ملف FASTA للمحاذاة ، وحدد DNA كنوع من التسلسل ، واختر الصرامة التي تناسب التحليل. بالنسبة لمحاذاة عائلة جينات ATL لكرمة العنب ، حدد جميع الخيارات الثلاثة المقترحة لاختيار أقل صرامة بسبب اختلاف التسلسل العالي. ثم انقر فوق الحصول على الكتل لتشغيل التحليل.

لحفظ النتائج ، انقر فوق المحاذاة الناتجة في أسفل صفحة الإخراج وقم بإنشاء ملف FASTA جديد. تقضي كتل G على الموضع المحاذاة بشكل سيئ في المناطق المتباينة من الحمض النووي أو محاذاة الحث بحيث تصبح أكثر ملاءمة لتحليل النشوء والتطور. في هذه الخطوة ، يعد اختيار المعلمة غير الضرورية لصرامة الأعمدة أمرا بالغ الأهمية للتأكد من أنها مسؤولية الثلاثة.

لإكمال الشجرة ، ننتقل إلى الصفحة الرئيسية ل Phylogeny France. هناك ، حدد خط أنابيب الانتقائي وقم بإلغاء تحديد الخيارات التالية: تنظيم المحاذاة والمحاذاة المتعددة. بعد ذلك ، انقر فوق إنشاء سير عمل ، وقم بتحميل ملف FASTA المنسق G-blocks ، وحدد إجراء bootstrapping ، واستخدم المعلمات والإعدادات الافتراضية.

أخيرا ، انقر فوق إرسال لتشغيل التحليل. هذا يكمل العملية خطوة بخطوة. الآن بعد أن تم إنشاء شجرة النشوء ، قم بطي الفروع المدعومة بشكل سيئ بقيم تمهيد أقل من 70٪ ثم قم بتنزيل النتائج النهائية بتنسيق Newick لمزيد من التحليل.

يوفر بروتوكول النص إرشادات حول تعيين اسم الجين بناء على السلالة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بإنشاء ملف تنسيق نصي مضغوط ومطي لقيم التعبير الطبيعية للأذرع المأخوذة من مكتبة تعبير جين. قم بتنظيم قيم كل جين عائلي تحت نفس صفوف النمط.

بعد ذلك ، قم بإجراء التحليل الهرمي ثنائي المجموعات باستخدام برنامج عارض متعدد التجارب. أولا ، قم بتحميل مصفوفة بيانات العمل وحدد الملف النصي. حدد صفيف أحادي اللون وقم بإزالة العلامة من تعليق التحميل عند عدم توفير تعليق توضيحي تلقائي.

حدد قيمة التعبير العلوية اليسرى لمعاينة جدول التعبير وانقر فوق زر التحميل. بعد ذلك ، اضبط البيانات ، وقم بتطبيق تحويل Log2 وتطبيع الجينات / الصف. ثم قم بتعيين حد المقياس المناسب.

الآن احسب التجميع الهرمي. في حقل تحسين الطلب، حدد تحسين ترتيب أوراق الجينات وتحسين ترتيب أوراق العينة. بعد ذلك، في حقل تحديد أسلوب الارتباط، حدد متوسط تجميع الارتباط وفي حقل تحديد مصفوفة المسافة اختر ارتباط بيرسون.

ثم انقر فوق موافق لتشغيل التحليل. اعرض النتائج في اللوحة اليسرى من النافذة وقم بتصدير خريطة الحرارة بالنقر فوق حفظ الصورة في قائمة الملف. تم استخدام الجين الأكثر تشابها مع arabidopsis thaliana ATL2 ، وفقا لبحث BLAST-P لمسح أفراد عائلة ATL في جينوم كرمة العنب.

تقارب تحليل PSI BLAST بعد بضع دورات لتوفير قائمة بالجينات المفترضة في عائلة الجينات. تم تقييم وجود مجال H2 الحلقة الكنسية لكل مرشح من خلال الفحص البصري لمحاذاة العضلات. أدى هذا إلى تضييق نطاق البحث إلى 96 جينا من جينات كرمة العنب.

تم استخدام تحليل النشوء والتطور للجينات المحددة ، ومقارنتها بعائلة جينات arabidopsis ATL للتسمية. تلقى 13 من 96 ATLs من كرمة العنب معرفا محددا باعتباره تقويم العظام الجيني arabidopsis ATL. أظهر تعيين الجينات المحددة إلى أطلس التعبير الجيني العالمي لكرمة العنب باستخدام تحليل هرمي ثنائي العنقود أن جميع الجينات ال 96 يتم التعبير عنها في نسيج واحد على الأقل ويمكن تحديد خمس مجموعات تعبير.

تم تطبيق نهج مماثل لدراسة التعبير عن هذه الجينات استجابة للضغوط الحيوية. كانت هناك مشاركة مباشرة لعائلة جينات ATL استجابة لعدوى مسببات الأمراض مع 62 جينا تظهر تعديلا كبيرا في حالتين على الأقل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع البرامج المستخدمة لتوصيف عائلة الجينات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحديد خصائص عائلة جينية معينة بعناية والمسبار المقابل المستخدم لتحديد أفراد عائلة الجينوم بأكمله. باتباع هذا الإجراء ، من الممكن التحقيق في تطور عائلة الجينات ووظيفة P30 عن طريق إنشاء أشجار النشوء والتطور الإضافية بناء على بعض الأنواع بخلاف الأنواع المطلوبة لإسناد تسمية عائلات الجينات.